Синтез фотохромного трансмембранного белка бактериородопсина галобактерией Halobacterium halobium

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

1

http://naukovedenie.ru 13TVN214

УДК 577.37 + 537.86
03.00.00 Биологические науки,
03.00.02 Биофизика

Мосин Олег Викторович 

ФГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Россия, Москва

Научный сотрудник, кандидат химических наук

E-mail: mosin-oleg@yandex.ru

Игнатов Игнат

Научно-исследовательский Центр медицинской биофизики (НИЦМБ)

Болгария, София1

Профессор, доктор наук

E-mail: mbioph@dir.bg

Синтез фотохромного трансмембранного белка 

бактериородопсина галобактерией Halobacterium halobium

Аннотация: В данной статье сообщается о микропрепаративном микробиологическом 

синтезе природного фотопреобразующего белка бактериородопсина (выход 8–10 мг) 
фотоорганотрофной галобактерией Halobacterium halobium, способного преобразовывать 
световую энергию в электрохимическую энергию генерируемых протонов H+ и АТФ, что 
важно для наноиндустрии новых современных отечественных фотопреобразующих 
наноматериалов и биомолекулярной электроники. Рассмотрены основные технологические 
стадии выделения и очистки бактериородопсина. Белок выделен из пурпурных мембран 
обработкой бактериальной биомассы ультразвуком при 22 кГц, спиртовой экстракцией низкои высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов с последующей 
солюбилизацией конечного продукта 0,5%-ном додецилсульфате натрия (ДДС-Na) и 
фракционированием 
метанолом. 
Гомогенность 
синтезируемого 
бактериородопсина 

исследованы комбинацией методов разделения и анализа белка, включая электрофорез в 
12,5%-ном полиакриламидном (ПААГ) геле с 0,1%-ным ДДС-Na, гель-проникающую 
хроматографию на сефадексе G-200.

Ключевые слова: Halobacterium halobium; пурпурные мембраны; бактериородопсин;

биомолекулярная электроника.

Идентификационный номер статьи в журнале 13TVN214

1 1111, Болгария, София, ул. Николая Коперника, д. 32

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

2

http://naukovedenie.ru 13TVN214

Введение

Бактериородопсин был впервые выделен из клеточной мембраны экстремальной 

аэробной фотоорганотрофной палочковидной галобактерии Halobacterium halobium в 1971 
году В. Стохениусом (США) и Д. Остерхельтом (ФРГ) [1]. Он представляет собой 
хромопротеид с молекулярной массой 26,7 кДа, связанный альдиминной связью с остатком 
лизина-216, который содержит в качестве хромоформной группы эквимолекулярную смесь 
13-цис- и полностью 13-транс-ретинольного С20-каротиноида – аналога витамина А, 
определяющего пурпурно-красный цвет галобактерий. Наряду с бактериородопсином в 
клеточной мембране галофилов содержатся другие сопутствующие каротиноидные пигменты, 
основной из которых бактериоруберин, обусловливающий окраску галобактерий от розового 
до красного и красно-оранжевого цветов, что имеет для галофилов важное значение как 
средство защиты против избыточной радиации и солнечного излучения, так как для мест их 
обитания характерна высокая освещенность.

Несмотря на изученность структуры и функций бактериородопсина, он остается в 

центре внимания биои нанотехнологии прежде всего благодаря своей высокой 

светочувствительности и разрешающей способности, и используется в молекулярной 
биоэлектронике как природный фотохромный материал для управляемых светом или 
электрическими импульсами модулей компъютерных и оптических систем [2]. Кроме того, 
бактериородопсин очень привлекателен как модельный объект для исследований, связанных с 
изучением функциональной активности и структурных свойств фотопреобразующих белков в 
составе искусственных нативных энерго- и фотопреобразующих мембран [3].

Природные фотопреобразующие наноматериалы также представляют большую 

ценность для коммерческой нано- и биотехнологии, микроэлектроники, биофотоники, а также 
биофизических исследований [4]. Например, бактериородопсин-содержащие нанопленки, 
полученные с использованием пурпурных мембран галобактерий, используются в качестве 
компонента в биомолекулярной электроники, использующей биоматериалы и принципы 
переработки информации биологическими объектами в вычислительной технике для создания 
электронных устройств. Впервые в мире такие пленки на основе молекул бактериородопсина 
были получены и исследованы в нашей стране в рамках проекта “Родопсин”, в ходе которого 
была продемонстрирована эффективность и перспективы использования наноматериалов 
“Биохром” 
в 
качестве 
фотохромных 
материалов 
для 
голографической 
записи 
и 

микроэлектронных устройств [5]. Эти наноматериалы обратимо изменяют свою структуру в 
ответ на физические воздействия и генерируют два дискретных состояния, подающихся 
измерению спектральными методами. Это определяет их дальнейшее использование в 
качестве логических вычислительных систем в биомолекулярной электронике. Так, на основе 
бактериородопсина был сконструирован фоторецептор с микроэлектродом из SnO2, 
состоящий из 64 ячеек (пикселей), размером 2,5×2,5 мм и напряжением 0,3–0,7 В. Для 
преобразования сигналов в данном фоторецепторе, слабый ток элементов (3–10 нА) 
усиливается до достижения) значения напряжения) от 1 до 10 В и затем подается на 
светоизлучающие диоды. Данная конструкция свидетельствует о возможности эффективной 
интеграции бактериородопсина в современные микроэлектронные системы.

Основной задачей при изготовлении бактериородопсин-содержащих нанопленок 

является ориентация пурпурных мембран, между гидрофобными и гидрофильными средами, 
например, между водой и воздухом, как это распространено в природе. Как правило, для 
улучшения характеристик бактериородопсин-содержащих пленок, используется несколько 
слоев пурпурных мембран, которые наносятся на поверхность полимерного носителя –
подложки и высушиваются в определенных условиях с сохранением своей природной 
структуры. Подложка, на которой сформирован препарат, может быть изготовлена из 

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

3

http://naukovedenie.ru 13TVN214

натуральных и синтетических полимеров, гидрогелей, стекла, керамики, металлов и быть 
электропроводящей, многослойной, нести на себе функциональные подслои и т.д. Наилучшие 
показатели достигаются при изготовлении нанопленок на основе желатина. Это позволяет 
добиться высокой концентрации бактериородопсина (до 50 масс.%) в нанопленках, избежать 
агрегации фрагментов пурпурных мембран, а также разрушения бактериородопсина в 
процессе изготовления. Встроенные в желатиновую подложку фрагменты пурпурных 
мембран с бактериородопсином долговечны (время жизни 104 часов) и устойчивы к 
воздействию многих факторов, как при изготовлении, так и в процессе эксплуатации 
(колебания температуры, интенсивное воздействие светом с помощью лазера и др.). При 
высыхании пурпурные мембраны укладываются друг на друга, ориентируясь в плоскости 
подложки. Слой высохших мембран толщиной 1 мкм содержит около 200 монослоев. При 
освещении в таких сухих пленках регистрируется фотопотенциал 100–200 мВ, что совпадает с 
величиной мембранного потенциала живой клетки.

Большой научно-практический интерес к получению препаратов бактериородопсина 

для реконструкции нанопленок, определил цель настоящей работы, связанной с разработкой 
условий выращивания галобактерий Halobacterium
halobium
и оптимизаций условий 

выделения чистого бактериородопсина в микропрепаративных количествах.

Структура и механизм функционирования бактериородопсина

По своей структуре и расположению в мембране клетки бактериородопсин относится к 

интегральным трансмембранным белкам (рис. 1), пронизывающим всю толщу клеточной 
мембраны, которая подразделяется на три фракции: желтую, красную и пурпурную. 
Содержащая бактериородопсин пурпурная фракция образует естественные двумерные 
кристаллы, которые можно исследовать с помощью электронной микроскопии и 
дифракционных методов анализа – рассеивания рентгеновского излучения, электронов и 
нейтронов на поверхности кристаллов пурпурных мембран. Этими методами было доказано 
существование в молекуле бактериородопсина семи спиральных белковых сегментов, в 
середине которых симметрично расположена хромофорная часть молекулы в виде остатка 
ретиналя.

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

4

http://naukovedenie.ru 13TVN214

Рис. 1. Расположение белковой части молекулы бактериородопсина и остатка ретиналя в 

клеточной мембране галобактерии Halobacterium halobium по данным компьютерного 

моделирования:

белковые фрагменты молекулы бактериородопсина в виде 7 пронизывающих клеточную 

мембрану -спиральных сегментов обозначены латинскими буквами;

темным цветом обозначены сегменты, ответственные за связывание остатка ретиналя в 

молекуле бактериородопсина с белковой частью молекулы

Полипептидная цепь бактериородопсина состоит из 248 аминокислотных остатков, 

67% которых являются гидрофобными [6], а 33% –
гидрофильными остатками из 

аспарагиновой и глутаминовой кислотами, аргинина и лизина. Эти остатки играют важную 
структурно-функциональную роль в пространственной ориентации α-спиральных сегментов 
молекулы бактериородопсина, которая организована в пурпурной мембране упорядоченно в 
виде тримеров со средним диаметром около 0,5 мкм и толщиной 5–6 нм; каждый тример 
окружен шестью другими так, что образуется правильная гексагональная кристаллическая 
решетка. Отдельная молекула бактериородопсина состоит из семи находящихся в 
конформации α-спирали сегментов, расположенных в направлении, перпендикулярном 

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

5

http://naukovedenie.ru 13TVN214

плоскости цитоплазматической мембраны. Гидрофобные домены представляют собой 
трансмембранные сегменты, а гидрофильные домены выступают из мембраны и соединяют 
отдельные 
внутримембранные 
α-спиральные 
сегменты 
белковой 
части 
молекулы 

бактериородопсина. Наряду с бактериородопсином пурпурные мембраны содержат липиды, 
каротиноиды и воду [7]. Пурпурные мембраны устойчивы к солнечному свету, воздействию 
кислорода, температуре более чем 80 0C (в воде) и до 140 0C (на воздухе), рН от 1–12, высокой 
концентрации 
NaCl
(15–20 
масс.%), 
действию 
большинства 
ферментов-протеаз, 

чувствительны к смесям полярных органических растворителей с водой, но устойчивы к 
неполярным растворителям типа гексана. Эти факторы имеют большое практическое 
значение для встраивания пурпурных мембран в полимерные наноматрицы c cохранением 
фотохимических свойств.

Бактериородопсин 
выполняет 
в 
клетке 
галофилов 
функции 
светозависимого 

протонного насоса, перекачивающего протоны через мембрану клетки и создающего 
электрохимический градиент протонов Н+ на поверхности клеточной мембраны, энергия 
которого используется клеткой для синтеза АТФ в анаэробном фотосинтетическом 
фосфорилировании. Этот механизм синтеза АТФ получил название “бесхлорофильный 
фотосинтез” в отличие от реализуемого растениями фотосинтеза с участием хлорофилла. В 
этом механизме при каждом поглощении молекулой кванта света бактериородопсин 
обесцвечивается, вступая в цикл фотохимических превращений, в результате происходит 
высвобождение протона на внешней стороне мембраны и поглощение протона из 
внутриклеточного пространства. Вследствие этого между внутренней и внешней сторонами 
цитоплазматической мембраны устанавливается градиент концентрации протонов Н+ [8]. 
Механизм последующего переноса Н+ через мембрану клетки включает цепь водородных 
связей, образованных боковыми радикалами гидрофильных аминокислот и простирающихся 
через всю толщу белка. Протонная проводимость обеспечивается в том случае, если белок 
состоит из двух участков и содержит функциональную фотохромную группу, способную под 
воздействием кванта света изменять свое микроокружение и тем самым последовательно 
соединять и разъединять участки связывания и переноса Н+ через клеточную мембрану. Роль 
такого переносчика между двумя белковыми проводниками Н+, один из которых сообщается с 
внешней, а другой – с цитоплазматической поверхностью мембраны клетки, играет ретиналь, 
связанный альдиминной связью (как в зрительных пигментах животных [9]) с остатком 
лизина-216 белкового фрагмента молекулы бактериородопсина. Ретиналь имеет 13-трансконформацию и располагается в мембранном туннеле между белковыми α-сегментами, 
блокируя поток протонов. При поглощении кванта света происходит обратимая световая 
фотоизомеризация 13-Z-БР (макс = 548 нм) в all-E-БР (макс = 568 нм) [10], инициирующая 
каскад быстрых фотохимических реакций продолжительностью от 3 миллисекунд до 1 
пикосекунды, с образованием промежуточных интермедиантов J625, К590, L550, М412, N560, и O640 
с последующим отрывом Н+
от ретинального остатка бактериородопсина и его 

присоединением со стороны цитоплазмы (рис. 2). В этом процессе молекула ретиналя 
изменяет свою конфигурацию в мембранном туннеле, формируя канал трансмембранного 
переноса протонов из цитоплазмы во внешнюю среду, и переносит протон Н+ с внутренней 
цитоплазматической мембраны на внешнюю мембрану клетки. При этом протон из 
ретинального остатка переносится на остаток Асп-85, после чего образовавшаяся вакансия 
заполняется протоном, перешедшим с Асп-96. В результате между внутренней и внешней 
поверхностью мембраны образуется градиент концентрации Н+, приводящий к тому, что при 
освещении светом клетки начинают синтезировать АТФ, т.е. преобразуют энергию света в 
химическую энергию связей. Этот процесс обратим, и в темноте протекает в обратном 
направлении, когда бактериородопсин самопроизвольно возвращается в исходную форму 
[10]. Таким образом, молекула бактериородопсина ведет себя как фотохромный переносчик с 
малым временем релаксации –
переходом из возбужденного состояния в основное. 

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

6

http://naukovedenie.ru 13TVN214

Оптические и динамические характеристики бактериородопсина изменяются в зависимости 
от условий получения пурпурных мембран и составом полимерной матрицы.

Рис. 2. Схема фотохимического цикла молекулы бактериородопсина

(водная суспензия, рН 7,2, 20 0С).

Латинские цифры J, K, L, M, N, O обозначают спектральные интермедианты 
бактериородопсина. IM и IIМ обозначают спектральные интермедианты мета
бактериородопсина с протонированной и депротонированной альдиминной связью. Верхние 
индексы “c” и “t” относятся к циклам 13-цис- и 13-транс-производных бактериородопсина 

(БР), “L” и “D” обозначают световую и темновую формы бактериородопсина. Нижние 

индексы соответствуют положению максимума поглощения интермедиаторов фотоцикла 

(в нм). Символами 13-Z и all-E показаны изомеры бактериородопсина. hv – квант света. 
Продолжительности реакций измерены в мс (миллисекундах), мкс (микросекундах) и пкс 

(пикосекундах)

Биосинтез бактериородопсина

Технология 
получения 
бактериородопсина 
заключается 
в 
культивировании 

галобактерий на жидких синтетических средах (с 1520 масс.% NaCl), содержащих 
аминокислоты, или на природных средах с пептонами 
смесями полипептидов и 

аминокислот, получаемыми из продуктов неполного гидролиза сухого молока или мяса 
животных под действием протеолитических ферментов (пепсин, трипсин), или на белкововитаминном концентрате (БВК) дрожжей, с последующим выделением бактериородопсина из 
пурпурных мембран клеток комбинацией методов физико-химического разделения.

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

7

http://naukovedenie.ru 13TVN214

Для биосинтеза бактериородопсина использовали мутантный каротиноидсодержащий 

штамм экстремальных фотоорганотрофных галобактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001, 
полученный из коллекции культур МГУ. Штамм модифицирован селекцией отдельных 
бактериородопсин-синтезирующих колоний пурпурно-красного цвета на твердой (2 %-ный 
агар) пептоновой среде с 4,3 М NaCl. Полученный селекцией штамм галобактерий 
культивировали в жидкой комплексной синтетической среде (количества компонентов 
приведены в г/л), содержащей:

●
18 аминокислот: D,L-аланин — 0,43; L-аргинин  0,4; D,L-аспарагиновая 
кислота — 0,45; L-цистеин  0,05; L-глутаминовая кислота — 1,3; L-глицин —
0,06; D,L-гистидин — 0,3; DL-изолейцин — 0,44; L-лейцин — 0,8; L-лизин —
0,85; D,L-метионин — 0,37; D,L-фенилаланин — 0,26; L-пролин — 0,05; D,Lсерин — 0,61; D,L-треонин — 0,5; L-тирозин — 0,2; D,L-триптофан — 0,5; D,Lвалин — 1,0 г/л;

●
нуклеотиды: аденозин-5-монофосфат — 0,1; уридин-5-монофосфат — 0,1 г/л;

●
соли: NaCl — 250; MgSO4.7H2O — 20; KСl — 2,0; NH4Cl — 0,5; KNO3 — 0,1; 
KH2PO4 — 0,05; K2HPO4 — 0,05; Na+-цитрат — 0,5; MnSO4.2H2O — 3.10–4; 
CaCl2.6H2O — 0,065; ZnSO4.7H2O — 4.10-5; FeSO4.7H2O — 5.10–4; CuSO4.5H2O —
5.10–5 г/л;

●
глицерин — 1,0 г/л;

●
ростовые факторы: биотин — 1.10–4; фолиевая кислота — 1,5.10–4; витамин 
В12 — 2.10–5 г/л.

Выращивание бактерий проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (объем 

реакционной смеси — 100 мл) 3–4 сут. при 35–37 0С в условиях интенсивной аэрации (расход 
воздуха — 0,5–2 л/мин на 1 л среды) в орбитальном шейкере 380-S (“Biorad”, Венгрия) и 
освещении монохромными люминисцентными лампами ЛДС-40-2 (40 Вт) (ООО “АльфаЭлектро”, Россия) (3 лампы освещенностью 1,5 лк). Бактериальный рост изучали по 
оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной при длине волны λ = 620 нм на 
спектрофотометре Beckman DU-6 (“Beckman
Coulter”, США). Процедура выделение 

бактериородопсина из пурпурных мембран галобактерий и все последующие стадии 
выделения и очистки белка производились с использованием светозащитной лампы, 
снабженной оранжевым светофильтром ОРЖ-1X (75×50 см) (“Marbel”, Германия).

В оптимальных условиях выращивания галобактерий, показанных на рис. 3, б, 

относительно контроля (рис. 3, а) на пептоновой среде в клетке синтезировался 
каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и 
хромофорного фрагментов молекулы D280/D568 = 1,5 : 1 полностью идентичный природному 
бактериородопсину. Как показали результаты исследования, рост галобактерий Halobacterium
halobium на комплексной синтетической среде (рис. 3, б) ингибировался незначительно по 
сравнению с контролем (рис. 3, а) на пептоновой среде. Это существенно упрощает и 
удешевляет оптимизацию условий биосинтеза бактериородопсина, которые заключаются в 
культивировании галобактерий в синтетической среде при освещении монохромным светом с 
длиной волны λ = 560 нм в течение 45 сут при 35 0С. Существенным преимуществом 
является то, что в отличие от пептоновой среды, синтетическая среда не содержит в своем 
составе загрязняющих белковых продуктов, которые могут усложнить последующее 
выделение и очистку бактериородопсина.

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

8

http://naukovedenie.ru 13TVN214

Рис. 3. Динамика роста галобактерии Halobacterium halobium, измеренная по оптической 

плотности клеточной суспензии при λ = 620 нм на спектрофотометре Beckman DU-6 

(“Beckman Coulter”, США) в различных экспериментальных условиях:

пептоновая среда (а), комплексная синтетическая среда (б). Условия выращивания: период
инкубации 4–5 сут при 35 0С, освещение монохромным светом с длиной волны λ = 560 нм. 

Контроль – пептоновая среда

Выделение и очистка бактериородопсина

Основными этапами получения бактериородопсина являлись:

●
выращивание галобактерий Halobacterium halobium на синтетической среде;

●
дезинтеграция клеток и лизис клеточных стенок;

●
выделение фракции пурпурных мембран;

●
очистка пурпурных мембран от низко- и высокомолекулярных примесей, 
клеточной РНК, каротиноидов и липидов;

●
растворение пурпурных мембран в 0,5%-ном растворе ионного детергента 
додецилсульфата натрия (ДДС-Na) с образованием микроэмульсии;

●
Осаждение бактериородопсина из микроэмульсии метанолом;

●
гель-проникающая хроматография (ГПХ) на сефадексе G-200;

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

9

http://naukovedenie.ru 13TVN214

●
электрофорез в 12,5%-ном полиакриламидном (ПААГ) геле с 0,1%-ным ДДСNa.

Поскольку выделяемый белок локализуется в пурпурных мембранах, освобождения от 

низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим 
шоком клеток дистиллированной водой на холоде после удаления 4,3 М NaCl и последующим 
разрушением клеточной оболочки ультразвуком с частотой 22 кГц. Последующую обработку 
клеточного гомогената ферментом РНК-азой  (23 ед. акт.) проводили для разрушения 
клеточной РНК. В результате получаются фрагменты пурпурных мембран, содержащих 
бактериородопсин [11]. Поскольку фракция пурпурных мембран наряду с выделяемым 
белком в комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных 
каротиноидов и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования 
белка без повреждения его нативной структуры и диссоциации ретинального остатка. Это 
существенно 
усложняло 
задачу 
выделения 
индивидуального 
бактериородопсина 
с 

применением методов декаротинизации и делипидизации (удаление каротиноидов и 
липидов),
а также очистки и колоночной ГПХ на сефадексе. Декаротинизация, 

заключающаяся в многократной обработке суспензии пурпурных мембран 50%-ным этанолом 
при 4 0С, являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери 
хромопротеина. Использовалось не менее пяти обработок 50%-ным этанолом, чтобы получить 
спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) пурпурных мембран 
(степень хроматографической чистоты 8085 %), показанного на рис. 4 на различных стадиях 
обработки (б) и (в) относительно природного бактериородопсина (а). Образование 13ретинальпротеинового комплекса в молекуле бактериородопсина приводит к батохромному 
сдвигу в спектре поглощения пурпурных мембран (рис. 4, в). Основная полоса (1) при 
максимуме поглощения  = 568 нм, вызванная световой изомеризацией хромофора по 
С13=С14-кратной связи определяется наличием 13-транс-ретинального остатка в основной 
спектральной форме БР568, а дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при =412 нм 
характеризует незначительную примесь образующейся на свету спектральной формы метабактериородопсина M412 c депротонированной альдиминной связью между остатком 13транс-ретиналя и белком (рис. 4, а–в). Общая полоса (3) при =280 нм определяется 
поглощением 
ароматических 
аминокислот 
(фенилаланин, 
тирозин, 
триптофан) 
в 

полипептидной цепи белка (для чистого бактериородопсина соотношение поглощений 
D280/D568 равно 1,5 : 1). Данный метод биосинтеза бактериородопсина позволяет для лучшего 
результата контролировать содержание ароматических аминокислот –
фенилаланина, 

тирозина и триптофана в ростовой среде штамма-продуцента, добавляемых в количествах 
0,26, 0,2 и 0,5 г/л.

Интернет-журнал «НАУКОВЕДЕНИЕ»
Выпуск 2, март – апрель 2014
Опубликовать статью в журнале - http://publ.naukovedenie.ru

Институт Государственного управления, 

права и инновационных технологий (ИГУПИТ)
Связаться с редакцией: publishing@naukovedenie.ru

10

http://naukovedenie.ru 13TVN214

Рис. 4. Спектры поглощения суспензии пурпурных мембран (в 50%-м растворе этанола (в 

Н2О)) на различных стадиях обработки: природный бактериородопсин (а); пурпурные 

мембраны после промежуточной обработки (б); очищенные от посторонних каротиноидов 

пурпурные мембраны (в). Полоса (1) – основная спектральная форма бактериородопсина 
БР568, (2) – примесь спектральной формы мета-бактериородопина М412, (3) – общая полоса 
поглощения ароматических аминокислот, (4) и (5) – посторонние каротиноиды. Контроль –

природный бактериородопсин. Вертикальная ось (D) означает поглощение (отн. ед.), 
горизонтальная ось – диапазон длин волн (нм) при сканировании спектрофотометром

Фракционирование и тщательная хроматографическая очистка белка являлись 

следующим необходимым этапом. Поскольку бактериородопсин, будучи трансмембранным 
белком, пронизывает билипидный слой в виде семи α-сегментов, применение сульфата 
аммония и других традиционных высаливающих агентов не дает положительного результата 
при выделении белка. Решение проблемы заключалось в переводе белка в растворимую 
форму за счет коллоидного растворения (солюбилизацией) полученной фракции пурпурных 
мембран в 0,5%-ном растворе ДДС-Na с последующим низкотемпературным осаждением из 
них белка метанолом. Использование в качестве ионного детергента ДДС-Na диктовалось 
необходимостью 
максимальной 
солюбилизации 
белка 
с 
комбинированием 
стадии 

делипидизации и осаждения в нативном (с сохранением природной конфигурации) виде, 
поскольку солюбилизированный бактериородопсин сохраняет спиральную α-конфигурацию 
[12]. Поэтому отпала необходимость использования органических растворителей — ацетона, 
метанола и хлороформа для очистки от липидов, а делипидизация и осаждение белка 
совмещались в одну единственную стадию, существенно упрощающую фракционирование