БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ПРИРОДНОГО КАТЕЛИЦИДИНА

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ПРИРОДНОГО 

КАТЕЛИЦИДИНА

А.Ю. Артамонов *, О.В. Шамова*,**, Д.С. Орлов*,**, Н.И. Колодкин ***, 

М.П. Смирнова***

*- Отдел общей патологии и патофизиологии (зав. – д.б.н., О.В. Шамова) 
ФГБНУ «ИЭМ»; **- Кафедра биохимии (зав. – д.б.н., В.Е.Стефанов) СПбГУ; 

*** - Лаборатория  химии пептидов (зав. – д.б.н., А.А. Колобов) ФГУП 

«ГНИИ ОЧБ» ФМБА России

auartamonov@bk.ru, Артамонов А. Ю.

Ключевые слова:
врожденный иммунитет, антимикробные пептиды, 

кателицидин

Введение. 
Проблема 
преодоления
устойчивости 
патогенных 

микроорганизмов 
к 
широко 
используемым 
типам 
противобактериальных 

лекарственных 
средств 
[2] 
может 
быть 
решена 
путем 
применения 

антимикробных пептидов (АМП) системы врожденного иммунитета, которые 
рассматриваются как перспективная основа для разработки препаратов с 
антибактериальными, 
фунгицидными, 
противоопухолевыми 
и 

иммунокорригирующими 
свойствами. 
Создание 
различных 
структурных 

модификаций природных АМП и анализ их биологической активности 
позволяет выявить направления оптимизации
функциональных свойств этих 

молекул для практического применения. Цель исследования: изучение 
антимикробной, гемолитической, цитотоксической активности, влияния на 
проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E.coli штамм ML-35p 
природного пептида индолицидина (Ind) [3] и его синтетических аналогов 
– пептидов АП1, АП2, АП3, АП4, АП5, АП6.

Методика исследования. Проведен анализ биологической активности 

следующих пептидов, полученных методом твердофазного синтеза: Ind 
(ILPWKWPWWPWRR-NH2), АП1 (ILPWAWPWWPWRR-NH2), АП2 (ILPWKKPWKPWRR-NH2), 
АП3 (IKPWKWPWKPWRR-NH2), АП4 (IKPWKWPWKPWAR-NH2), АП5 (KKPWKWPKKPWRRNH2), 
АП6 
(IKKWKKPWKKWRR-NH2). 
В 
работе 
использованы 
следующие 

бактерии: Escherichia coli, штамм ML-35p; Listeria monocytogenes, штамм 
EGD; Staphylococcus aureus, штамм 710а, а также культура клеток К562 
миелоидной лейкемии. Эритроциты человека получены от здоровых доноров 
20-30 лет. 

Количественная оценка антимикробной активности изучаемых пептидов, 

выраженная в значении минимальной ингибирующей рост микроорганизмов 
концентрации (МИК), определена с помощью маркера метаболической 
активности – ресазурина. Гемолитический эффект антимикробных пептидов в 
отношении 
эритроцитов 
человека 
основан 
на 
измерении 
оптической 

плотности проб, содержащих гемоглобин, вышедший из лизированных 
эритроцитов, при длине волны 540 нм. Цитотоксическое действие пептидов 
исследовали с помощью МТТ-теста. Изменение проницаемости мембран 
бактерии E. coli штамм ML35p при воздействии использованных в работе 
пептидов исследовали применяя хромогенные маркеры ONPG и нитроцефин, 
являющиеся субстратами для ферментов β-галактозидазы (в цитоплазме) и 
β-лактамазы (в периплазматическом пространстве), соответственно [1].

Результаты исследования.
Установлены следующие значения МИК для 

пептидов Ind, АП1, АП2, АП3, АП4, АП5 и АП6: 1,25; 5,00; 0,31; 0,63; 

1,25; 0,63 и 2,50 мкМ, соответственно (в отношении E. coli, ML-35p), 
1,25; 2,50; 5,00; 5,00; 5,00; 2,50 и 0,63 мкМ,  соответственно (L. 
monocytogenes, EGD); 2,50; 2,50; 5,00; 5,00; 5,00; 5,00 и 2,50 мкМ,  
соответственно (S. aureus, 710а). Все исследованные в работе пептиды в 
концентрации 20 мкМ через 30 мин инкубации увеличивают проницаемость 
внешней мембраны E. coli, штамм ML-35p, кроме того Ind, АП1, АП4 и АП6 
повышают проницаемость внутренней мембраны E. coli, штамм ML-35p, в 
отличие от АП2, АП3 и АП5. При инкубировании пептидов Ind и АП1 в 
концентрации 100 мкМ с эритроцитами человека процент гемолиза составлял 
30,0 и 16,7 %, соответственно; в то время как у других пептидов - АП2, 
АП3, АП4, АП5 и АП6 гемолитическая активность была существенно ниже: 
1,6; 3,3; 3,3; 0,8 и 0,1%, соответственно. В результате оценки 
цитотоксичности пептидов в отношении клеток К562 установлено, что 
концентрация пептидов Ind, АП1, АП3,  АП4, АП6, АП5 и АП2 при которой 
происходит ингибирование роста половины общего количества клеток (IC50) 
составляет 3,1; 3,9; 8,7; 14,8; 16,1;  24,6 и 35,9 мкМ, соответственно. 
Особенностью структур пептидов АП2 и АП6 является замена аминокислоты 
триптофан в шестом и девятом положении на лизин.
Эти пептиды имеют 

более высокий заряд (+6 и +9, соответственно), в сравнении с зарядом (+ 
4) молекулы Ind, и менее выраженные гидрофобные свойства, что возможно, 
обусловливает их более низкую токсичность против клеток макроорганизма.

Таким 
образом, 
пептиды 
АП2 
и 
АП6 
являются 
перспективными 

антибиотическими молекулами для разработки на их основе корректоров 
защитных функций - новых лекарственных препаратов пептидной природы.

Литература. 
1. Артамонов А. Ю., Шамова О. В., Кокряков В. Н. и др. // Вестн. 

СПбГУ. -2008. -Сер. 3, Вып. 3. -С. 79—86;  

2. ISBN: 978 92 4 156474 8  [Electronic resource] // WHO [Official 

site]. 
URL 

http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/; 

3. Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L. et. al. // J. Biol. 

Chem. – 1992. Vol. 267(7). – P. 4292-4295.

Работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-02102а и проблемой «Протеом 

человека».

BIOLOGICAL ACTIVITY OF SYNTHETIC CATHELICIDIN-DERIVED 

PEPTIDES

A.Yu. Artamonov*, O.V. Shamova*,**, D.S. Orlov*,**, N.I. Kolodkin***, 

M.P. Smirnova***

*- Department of General Pathology and Pathophysiology (The head – PhD, 

O.V. Shamova) Institute for Experimental Medicine; **- Department of 
Biochemistry (The head – PhD, V. E. Stefanov) Saint-Petersburg State 

University; *** - Laboratory of Chemistry of Peptides (The head – PhD, 
A.A. Kolobov) State Research Institute of Highly Pure Biopreparations 

of the Federal medical biological agency of Russia

auartamonov@bk.ru

Key words: innate immunity, antimicrobial peptides, cathelicidin

Introduction. A growing public problem of overcoming resistance of 

pathogenic microorganisms to existing antimicrobial drugs [2] may be 
resolved by using antimicrobial peptides (AMP) of innate immunity for 
developing the novel
therapeutics with antibacterial, fungicidal, 

antitumor and immunomulatory activities. A design of varied AMP-derived 
peptides and analysis of their biological action lead to the selection 
of the most suitable directions for the optimization of functional 
properties of these substances for their use in medicine. A goal of the 
current research is an investigation of the antimicrobial action of a 
peptide of the cathelicidin family – indolicidin [3] in comparison with 
its synthetic structural variants (AP1-AP6), exploration of their 
effects on the permeability of outer and inner membranes of E.coli ML35p and analysis of the cytotoxity for human cells including the 
hemolytic activity.

Methods. The following peptides have been designed and produced by 

the solid phase chemical synthesis: Ind (ILPWKWPWWPWRR-NH2), AP1 
(ILPWAWPWWPWRR), 
AP2 
(ILPWKKPWKPWRR), 
AP3 
(IKPWKWPWKPWRR), 
AP4 

(IKPWKWPWKPWAR), AP5 (KKPWKWPKKPWRR), AP6 (IKKWKKPWKKWRR). For an 
examination of their biological activity we used Gram-negative and 
Gram-positive bacterial strains: Escherichia coli, ML-35p; Listeria 
monocytogenes, EGD; Staphylococcus aureus, 710а; cultured human 
erythroleukemia cells K-562 and human red blood cells obtained from 
healthy donors. The antimicrobial activity data are presented as 
minimal inhibitory concentrations (MIC) measured by using a metabolic 
activity marker – resazurin. Changes in the permeability of outer and 
inner membranes of E. coli ML-35p upon the treatment with the peptides 
were studied using the permeability markers – ONPG and nitrocefin which 
served as substrates for the cytoplasmic enzyme β-galactosidase and βlactamase of a periplasmic space [1]. A hemolytic effect of AMPs toward 
human erythrocytes was estimated by the measurement of optical density 
(at 540 nm) of the samples containing hemoglobin released from lysed 
red blood cells. The cytotoxic activity was evaluated by MTT-test. 

Results. We have found the following values of MICs for the 

investigated indolicidin-derived peptides AP1, AP2, AP3, AP4, AP5, AP6 
and Ind: 5.00; 0.31; 0.63; 1.25; 0.63; 2.50 and 1.25 µM, respectively 
(against E. coli, ML-35p); 2.50; 5.00; 5.00; 5.00; 2.50; 0.63 and 1.25, 
respectively (against L. monocytogenes, EGD); 2.50; 5.00; 5.00; 5.00; 
5.00; 2,50 and 2.50, respectively (against S. aureus, 710а). All 
studied AMPs (at the concentration of 20 µM) increased the permeability 
of the outer membrane of E.coli ML-35p for the marker molecule 
(nitrocefin) after 30 min of incubation with bacteria. The peptides 
Ind, AP1, AP4 and AP6 also caused an increase in permeability of the 
cytoplasmic membrane of E.coli ML-35p (for the marker ONPG) while the 
others AP2, AP3 and AP5 did not affect the inner membrane of the 
bacteria. An original Ind and its variant AP1 taken at the 
concentration of 100 µM demonstrated hemolytic effects for human 
erythrocytes: they caused 30.0 and 16.7% of hemolysis respectively, 
while the peptides AP2, AP3, AP4, AP5 and AP6 at the same concentration 
practically had a lack of the hemolytic activity (1.6; 3.3; 3.3; 0.8 
and 0.1% of hemolysis, respectively). The cytotoxic activity of the 
studied AMPs toward K-562 cells in vitro was measured, and the 

following values of 50% inhibitory concentration have been obtained for 
peptides Ind, AP1, AP3, AP4, AP6, AP5 and AP2: 3.1; 3.9; 8.7; 14.8; 
16.1;  24.6 and 35.9 µM, respectively.

The main structural characteristic of the peptides AP2 and AP6, 

distinguishing them from Ind and its other variants, is a replacement 
of tryptophan residues at the position 6 and 9 to lysins which caused 
an increase in their positive net charge (+6 for AP2 and +9 for AP6) 
comparing with Ind (+4) and a decrease in hydrophobicity. These 
properties may result in their lowered toxicity for the host cells, and 
therefore such the substances might be considered as promising 
templates for the design of novel antibiotics on their base.

Reference. 
1. Artamonov A. Yu., Shamova O.V., Kokryakov V. N. et al. // 

Vestnik SPbSU. -2008. - Vol. 3, N. 3. - P. 79—86;  

2. ISBN: 978 92 4 156474 8 [Electronic resource] // WHO [Official 

site]. 
URL 

http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/; 

3. Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L. et. al. // J. Biol. 

Chem. – 1992. Vol. 267(7). – P. 4292-4295.

The work was supported by RFBR grant # 13-04-02102a and The Human 

Proteom Problem.

DOI:10.12737/12294

РЕАКЦИЯ ЛИМФОИДНЫХ СТРУКТУР И ИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ С 

БРУННЕРОВЫМИ ЖЕЛЕЗАМИ У АКТИВНЫХ И ПАССИВНЫХ КРЫС, ПОСЛЕ 

ДЕЙСТВИЯ СТРЕССА

А.А. Бахмет, Д.В. Мирошкин, М.А. Кузнецова, Е.В. Коплик

ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова

anastasbakhmet@mail.ru

Ключевые слова:
двенадцатиперстная кишка, стресс, лимфоидная 

ткань, активные и пассивные крысы.

Микроскопически и морфометрическими методами были исследованы 

особенности структурной организации и взаимоотношения с железами 
лимфоидных структур двенадцатиперстной кишки крыс после действия на них 
стресса. 
Предварительно 
комплексом 
физиологических 
методов 
была 

доказана индивидуальная устойчивость к действию эмоционального стресса, 
которой отличались крысы этой экспериментальной группы [1,2,3] Крысы 
контрольной группы также характеризовались устойчивостью к стрессовым 
факторам, но они не подвергались экспериментальным воздействиям. 

Целью явилось изучение структурно-функциональных характеристик 

лимфоидных образований и бруннеровых желез у активных и пассивных крыс, 
после действия стресса.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проведены на 55 крысах самцах Вистар (масса тела 220–300 г). 

После тестирования в открытом поле [1] были выделены поведенчески 
пассивные (n=30) и активные особи (n=20). В качестве модели острой 
стрессорной нагрузки использовали 1-ч иммобилизацию крыс в пластиковых