Современные проблемы биохимии. Методы исследований

Ìèíñê
«Âûøýéøàÿ øêîëà»
2013

Допущено
Министерством образования 
Республики Беларусь
в качестве учебного пособия
для магистрантов учреждений 
высшего образования,
по биологическим 
и медицинским специальностям 

 

Ñîâðåìåííûå ïðîáëåìû
áèîõèìèè

Методы исследований

Под редакцией профессора А.А. Чиркина

УДК 577.1(075.8)
ББК 28.072я73
 
С56

А в т о р ы: Е.В. Барковский, С.Б. Бокуть, А.Н. Бородинский, В.У. Буко, 
О.И. Валентюкевич, А.И. Грицук, Е.О. Данченко, Е.М. Дорошенко, И.К. Дремза, А.С. Дроздов, И.Б. Заводник, Л.Б. Заводник, Д.Я. Задорожный, Л.М. Караедова, В.Н. Кипень, Е.И. Коваленко, Е.А. Лапшина, Т.Л. Лебедь, О.Я. Лукивская, Г.В. Ляхнович, А.Ф. Макарчиков, С.Б. Мельнов, Е.В. Морозова, 
И.М. Морозова, Л.И. Надольник, Е.Е. Нарута, В.Н. Никандров, Л.Н. Николаевич, Н.В. Пивень, Н.С. Пыжова, В.Ю. Смирнов, Э.П. Титовец, Т.А. Толкачева, В.В. Хрусталев, В.Т. Чещевик, А.А. Чиркин

Ре ц е н з е н т ы: кафедра биохимии биологического факультета Белорусского государственного университета (заведующий кафедрой доцент 
И.В. Семак); заведующий отделом биохомии и биотехнологии растений ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси» доктор биологических наук В.Н. Решетников

Все права на данное издание защищены. Воспроизведение всей книги 
или любой ее части не может быть осуществлено без разрешения издате льства

ISBN 978-985-06-2192-4 
© Оформление. УП «Издательство
 
“Вышэйшая школа”», 2013

ПРЕДИСЛОВИЕ

Учебное пособие создано в соответствии с учебным планом и базовой программой подготовки студентов по специальности 1-31 01 01-02 Биология (научно-педагогическая деятельность); специализация 1-31 01 01-02 05 Биохимия. Этот 
предмет завершает подготовку специалистов в 10-м семестре 
обучения студентов и предназначен для ознакомления обучаемых с характером биохимических исследований, проводимых 
в ряде вузов Министерства образования и научно-исследовательских институтах Национальной академии наук Республики Беларусь. Учебное пособие не претендует на исчерпывающую информацию о многогранных биохимических исследованиях белорусских ученых. Данное издание должно продемонстрировать то, что биохимические методы исследования 
активно внедряются в фундаментальные и прикладные исследования не только в общепризнанных и авторитетных научных и педагогических центрах г. Минска, но и в других городах республики.
Изучение современных проблем биохимии служит для достижения основной цели: подготовить выпускника-биохимика 
к профессиональной деятельности и сократить время его 
адаптации к решению научных, производственных и учебных 
биохимических задач. В соответствии с этим пособие включает материалы по применению биохимических методов in silico (компьютерное моделирование), in vitro и in vivo. В материалах книги содержится более 190 методик биохимического 
анализа, 50 таблиц, более 90 рисунков, около 200 источников литературы. Потребность в таком издании вызвана 
тем, что стремительное развитие технологий биохимических 
исследований сокращает навыки биохимика-исследователя до 
этапа пробоподготовки, а остальное выполняют приборы. 
Наряду с классическими методами выделения и изучения 
ферментов, оценки обмена белков, углеводов, липидов, нукле

иновых кислот, состояния энергетического обмена, свободнорадикальных процессов в пособии представлены методы иммунохимического анализа, молекулярно-генетических исследований, анализа данных банков нуклеотидных и аминокислотных последовательностей макромолекул, исследование 
нанофлюидики. В практическом отношении будут полезными 
методики изучения фагоцитоза, апоптоза, некроза, биохимических характеристик тканей животного и растительного происхождения.
Глава 1 написана В.В. Хрусталевым, Е.В. Барковским, 
Д.Я. Задорожным; гл. 2 – А.С. Дроздовым, С.Б. Бокутем; 
гл. 3 – А.Ф. Макарчиковым; гл. 4 – Е.М. Дорошенко, 
В.Ю. Смирновым; гл. 5 – В.Н. Никандровым, Н.С. Пыжовой; гл. 6 – Л.И. Надольник, О.И. Валентюкевичем; гл. 7 – 
А.И. Грицуком; гл. 8 – Э.П. Титовцом; гл. 9 – Л.М. Караедовой; 
гл. 10 – А.Н. Бородинским, И.К. Дремзой; гл. 11 – В.У. Бу ко, 
О.Я. Лукивской, Е.Е. Нарутой; гл. 12 – Л.Б. Заводником, 
Е.А. Лап шиной, В.Т. Чещевиком, И.К. Дремзой, И.Б. Заводником; гл. 13 – Е.И. Коваленко, А.А. Чиркиным; гл. 14 – 
Е.О. Данченко; гл. 15 – Н.В. Пивень; гл. 16 – С.Б. Мельновым, 
Т.Л. Лебедь, В.Н. Ки пенем; гл. 17 – Т.А. Толкачевой, И.М. Моро зовой, Г.В. Ляхновичем; гл. 18 – Е.В. Морозовой, Л.Н. Николаевич, А.А. Чиркиным.

ГЛ А ВА  1 . БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЕ 
МЕТОДЫ ДЛЯ ОТБОРА КОМПОНЕНТОВ 
СИНТЕТИЧЕСКИХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ 
ВАКЦИН

Создание синтетических вакцин – одно из перспективных 
направлений в современной иммунохимии. К преимуществам 
синтетических вакцин (по сравнению с аттенуированными 
и инактивированными) относятся: безопасность, более высокая специфичность, снижение вероятности развития аллергических реакций. В состав синтетических вакцин входят короткие пептиды, соответствующие В-клеточным или Т-кле точным эпитопам полноразмерных вирусных белков. 
В последнее время синтез пептидов длиной до 30 аминокислотных остатков – рутинная и относительно недорогая 
процедура (для этого используются полностью автоматизированные синтезаторы). Короткие пептиды стало целесообразней синтезировать, чем получать с использованием биотехнологии. Не менее важным путем применения синтетических 
пептидов, соответствующих наименее мутабельным и наиболее консервативным В-клеточным эпитопам вирусных белков, 
является использование их в качестве антигенов для создания 
иммуноферментных тест-систем, которые можно использовать как в диагностических целях, так и для оценки напряженности иммунитета после вакцинации.

1.1. Схема отбора компонентов 
для синтетических вакцин

Идея создания синтетических вакцин получила распространение еще в 1980-е гг., однако реализация таких проектов 
оказалась затруднительной по нескольким причинам.

Первой причиной неудач является то, что не все участки 
белка иммуногенны. Проблему отбора наиболее иммуногенных фрагментов белка пытались решить путем создания способов предсказания линейных и конформационных В-клеточных эпитопов. Широкую известность получили шкалы гидрофильности и акрофильности аминокислотных остатков [1]. 
Однако даже те короткие участки белка, которые обладают 
наиболее выраженными антигенными свойствами, зачастую 
не дают перекрестных реакций с полноразмерными белками. 
Причиной является то, что далеко не каждый пептид сохраняет структуру, схожую с такой же структурой у соответствующей части полноразмерной молекулы. В связи с этим многие 
исследователи предпочитают работать над созданием рекомбинантных вакцин, основой которых, как правило, являются 
более крупные фрагменты белков (домены) [2]. В настоящей главе описывается процесс использования методов, позволяющих выделить наиболее иммуногенные участки белков, а также предлагается особый подход для отбора тех 
участков, которые должны с высокой долей вероятности сохранять свою структуру, будучи «изолированными» от оставшейся части полипептида.
Второй причиной неудач в процессе создания синтетических вакцин является высокая частота мутаций, присущая 
многим вирусам. До создания метода выделения наименее 
мутабельных (наименее подверженных аминокислотным заменам) участков белков [3], которому посвящена большая часть данной главы, эту проблему решали путем определения тех фрагментов белков, которые являются наиболее 
консервативными в процессе эволюции. По нашему мнению, 
данные подходы являются взаимодополняющими [4].
Предложенная схема работы по отбору компонентов для 
синтетических вакцин состоит из пяти этапов: 1) определение основных направлений мутационного давления в вирусном гене; 2) выделение наиболее иммуногенных областей 
в соответствующем вирусном белке; 3) предсказание вторичной структуры и сайтов гликозилирования для выделенных наиболее иммуногенных областей; 4) определение 
уровней мутабельности выделенных эпитопов; 5) оценка их 
консервативности. На каждом из последних четырех этапов число «кандидатов» на включение в состав синтетической вак цины может существенно сократиться. В результате 

такого отбора с помощью биоинформатических методов существенно сокращаются расходы на проведение последующих этапов исследования: синтеза пептидов, оценки их антигенных свойств с использованием аффинной хроматографии и иммуноферментного анализа, иммунизации лабораторных животных.
Основой для первого и четвертого этапов работы является 
теория направленного мутационного давления, согласно которой определенные типы нуклеотидных мутаций в данном гене 
происходят с большей частотой, чем другие [5]. Определить, 
какие именно типы мутаций происходят чаще, можно путем 
изучения частот использования нуклеотидов в тех сайтах нуклеотидных последовательностей, в которых они являются 
нейтральными [5].
С применением описанных ниже биоинформатических методов был выделен наименее мутабельный эпитоп поверхностного белка gp120 вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1) [3]. Соответствующий ему пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка, сохранил свои антигенные свойства: в крови 80,2 % людей с впервые выявленной 
ВИЧ1-инфекцией были обнаружены антитела, перекрестно 
реагирующие с ним [6].
В данной главе сконцентрировано внимание на гемагглютинине того штамма вируса гриппа H1N1, который вызвал эпидемию в 2009 г. [7]. По данным филогенетического анализа, этот 
штамм вируса гриппа (известный как «свиной грипп») продолжает циркулировать в человеческой популяции до настоящего 
времени.
Инактивированная вакцина Vaxigrip против гриппа изготавливается следующим образом: вирусы трех наиболее распространенных в текущем году штаммов культивируются на 
куриных эмбрионах, затем полученные вирионы разрушаются 
детергентом Triton X-100 и инактивируются раствором формальдегида. В результате данных процедур могут существенно изменяться антигенные свойства вирусных белков. Эффективность вакцинации (по данным производителя) достигает 
70 %. Использование синтетической вакцины может сократить количество аллергических реакций, обеспечить выработку антител к наименее мутабельным эпитопам поверхностных 
белков вируса (гемагглютинина и нейраминидазы), обладающих нейтрализирующей активностью, повысив эффективность вакцинации.

1.2. Определение основных направлений 
мутационного давления в вирусном гене

Для того чтобы определить основные направления мутационного давления в гене вируса, на первом этапе необходимо 
произвести расчет частот использования нуклеотидов в его 
четырехкратно и двукратно вырожденных сайтах третьих положений кодонов. С помощью алгоритма VVK Sliding Window 
(www.barkovsky.hotmail.ru) можно произвести расчет данных частот на протяжении одной нуклеотидной последовательности с использованием методики скользящего окна. Нуклеотидная последовательность копируется в обозначенную 
ячейку на листе «sequence», в другой ячейке на том же листе 
указывается длина скользящего окна в кодонах. После этого 
на листе «results» появляется номер ячейки, которой необходимо заканчивать графики. Сами графики находятся на соответствующих листах файла MS Excel. Использование MS Excel 
в качестве программной оболочки для подобных алгоритмов 
позволяет с легкостью использовать преимущества данной 
программы в процессе статистического анализа и визуализации данных.
Четырехкратно вырожденные сайты – сайты, в которых 
любая нуклеотидная замена является синонимичной (не вызывает замены аминокислотного остатка в кодируемом белке).
Двукратно вырожденные сайты третьих положений кодонов – сайты, в которых синонимичной является только 
транзиция, но не две возможные трансверсии.
Путем сравнения частот использования нуклеотидов в четырехкратно вырожденных сайтах можно определить преимущественное направление трансверсий, путем сравнения частот использования нуклеотидов в двукратно вырожденных 
сайтах – преимущественное направление транзиций.
На рис. 1.1, а видно, что частота использования (измеряется в долях единицы) аденина в четырехкратно вырожденных 
сайтах (A4f) на протяжении гена, кодирующего гемагглютинин штамма A/New York/INS151/2009 вируса гриппа H1N1, 
значительно превышает частоту использования цитозина (C4f). 
Для построения графиков, изображенных на рис. 1.1, использовалось скользящее окно длиной 100 кодонов с шагом в 1 кодон. В столбцах на листе «results» содержатся частоты использования нуклеотидов в соответствующих сайтах в каждом окне. С использованием функции MS Excel под названием 

Рис 1.1. Частоты использования нуклеотидов в четырехкратно (а, б) и двукратно (в, г) вырожденных сайтах третьих положений 
кодонов на протяжении участка, кодирующего гемагглютинин вируса гриппа H1N1, штамма A/NewYork/INS151/2009

1

0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
00
100
200
300
400
500
600
Длина гена в кодонах

Частота использования нуклеотида

1

0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
00
100
200
300
400
500
600
Длина гена в кодонах

Частота использования нуклеотида

1

0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
00
100
200
300
400
500
600
Длина гена в кодонах

Частота использования нуклеотида

1

0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
00
100
200
300
400
500
600
Длина гена в кодонах

Частота использования нуклеотида

A4f

C4f

U4f

G4f

A2f3p

G2f3p

U2f3p

C2f3p

а
б

в
г

«ТТЕСТ» можно проверить, достоверна ли разница между A4f 
и C4f на протяжении одного отдельно взятого гена по значению P (сравнение проводится с помощью попарного t-теста). 
Поскольку частоты использования нуклеотидов на протяжении гена подвержены колебаниям в довольно широких пределах, в том числе и вследствие случайных причин, целесообразней сравнивать уровни A4f и C4f попарно. Значение P 
для парной разности между A4f и C4f было меньше 0,001. 
Значение P для парной разности между частотами использования гуанина и урацила в четырехкратно вырожденных сайтах (G4f и U4f соответственно) составило 0,176, что свидетельствует о том, что разность эта недостоверна (см. рис. 1.1, б). 
Наиболее высокой в четырехкратно вырожденных сайтах является частота использования аденина.
Согласно теории мутационного давления [6], повышенная 
частота использования аденина в четырехкратно вырожденных сайтах является следствием того, что замены других нуклеотидов на аденин происходят чаще, чем замены аденина на 
другие нуклеотиды. Значительный вклад в это мутационное 
А-давление должны вносить трансверсии цитозина на аденин.
В двукратно вырожденных сайтах третьих положений кодонов разность между частотами использования урацила 
и цитозина (U2f3p и C2f3p) является достоверной (P < 0,001), 
несмотря на наличие участка (начиная с кодона 400 до терминального кодона), в котором уровень C2f3p превышает уровень U2f3p (см. рис. 1.1, в). Частота использования аденина 
в двукратно вырожденных сайтах достоверно превышает частоту использования гуанина (P < 0,001). Судя по этим данным, на участке, кодирующем гемагглютинин данного штамма вируса гриппа, транзиции гуанина на аденин и цитозина на 
урацил происходят чаще, чем обратные замены: транзиции 
аденина на гуанин и урацила на цитозин.
Если для четырехкратно вырожденных сайтов характерна 
картина А-давления, то для двукратно вырожденных сайтов 
характерна картина AU-давления. Почему частота использования урацила не достигла более высокого уровня в четырехкратно вырожденных сайтах? Наиболее вероятной причиной 
тому являются замены урацила на аденин, которые происходят в два этапа. Сначала возникает транзиция урацила на цитозин, а затем трансверсия цитозина на аденин. Последняя замена является синонимичной только в четырехкратно вырожденных сайтах.