Дифференцированная чувствительность b-клеточных и экстрапанкреатических АТФ-зависимых К-каналов к гликлазиду

О б щ и е в о п р о с ы . Патогенез 

Д
и
ф
ф
е
р
е
н
ц
и
р
о
в
а
н
н
а
я 
ч у в с т в и т е л ь н о с т ь 

р 
- 
к л е т о ч н ы х 
и 
э к с т р а п а н к р е а т и ч е с к и х 

А
Т
Ф 
- 
з
а
в
и
с
и
м
ы
х 
К 
- 
к а н а л о в 
к 
г л и к л а з и д у 

F.M. Gribble, F.M. Ashcroft 

University Laboratory of Physiology, Oxford, UK 

П

репараты сульфанилмочевины, которые используются в лечении сахарного диабета 2 
типа, стимулируют секрецию инсулина (}клетками, 
ингибируя 
АТФ-зависимые 
К-каналы 
(Кд Т Ф-каналы). 
К А Тф-каналы 
найдены 
в других 
тканях, включая мышечные волокна сердца, поперечнополосатые и гладкомышечные волокна, а также нейроны, где они связаны с метаболическим состоянием клетки и ее электрической активностью. В 
(3-клетках 
К А Тф-каналы 
регулируют 
мембранный 
потенциал, их активность зависит от клеточного метаболизма. Закрытие К А Тф-каналов в ответ на поступление глюкозы приводит к деполяризации клеточной мембраны; вслед за этим открываются Са
2 + 

каналы; Са входит внутрь клетки, вызывая высвобождение инсулина [1]. 

Кдтф-канал представляет собой восьмимерный (4+4) комплекс, состоящий из субъединиц двух типов: частица, формирующая поры, Kir6.2 и регулируемый рецептор к препаратам сульфанилмочевины (SUR), который обеспечивает канал высокоаффинной чувствительностью к производному сульфонилмочевины 
|2-4|. Были идентифицированы два SUR-гена, один из которых 
кодирует Р-клеточную изоформу рецептора (SUR1), другой — 
изоформы рецептора сердечной мышцы (SUR2A) и гладкомышечных волокон (SUR2B) [2,5,61. Этим объясняется дифференцированная тканевая селективность к препаратам сульфанилмочевины. Толбутамид обладает высоким сродством и блокирует 
Кдуф-каналы в (3-клетках, но оказывает незначительный эффект на сердечные каналы; глибенкламид обладает меньшей тканевой специфичностью, блокируя как (3-клеточные, так и сердечные Кд-рф-каналы [7,8]. В этой работе исследуется селективность гликлазида. 

М а т е р и а л ы и м е т о д ы 

ДНК мышей (Kir6.2), (Genbank D50581; [3]), крыс (SUR1) 
(Genbank L40624; [2]), (SUR2A), (Genbank D83598; [5]), (SUR2B) 
(Genbank D86038; [6]) были клонированы в pBF векторе. Стволовая форма Kir6.2 (Kir6.2rC36), в которой отсутствовали 36 аминокислот со стороны С- окончания и которая формирует функциональные каналы в отсутствие SUR, приготовлена по S.Tucker с 
соавт. [4|. Матричные РНК приготовлены in vitro при помощи 
транскрипционного набора (Ambion, Austin, Тех., USA). 

Ооциты набраны при помощи минилапаротомии из женской 
особи XENOPUS LAEV1S, анестезированной раствором MS222 (2 
г/л на воде). Незрелые ооциты на V-VI стадии инкубировались в 
течение 60 мин. в растворе коллагеназы — 1,0 мг/мл (Sigma, тип 
V, Pool, UK) и затем дефолликулировались вручную. В ооциты 

вводили либо 1 нг матричной РНК Kir6.2rC36, либо смесь из 0,1 
нг матричной РНК Kir6.2 и 2 нг матричной РНК, кодирующей 
один из типов SUR. Конечный уровень инъекций составил 50 
нл/ооцит. Изолированные ооциты помещали в раствор Барта и 
исследовали в течение 1-4 дней после инъекции [9]. 

Пипетки изготовлены из боросиликатного стекла и при наполнении раствором имели сопротивление 250-500 кОм. Макроскопический ток записывали с больших участков наружно-внутренней мембраны с потенциалом, поддерживаемым на уровне 0 
мВ и при температуре 20-24 °С[9]. Изменение электрического потенциала вызывали повторяющимся 3-вольтным перепадом тока 
от -ПО мВ до +100 мВ и записывали при помощи усилителя 
ЕРС7 (List Electronik, Darmstadt, Germany). 

Гликлазид был приготовлен как 0,1 ммоль/л КОН. Сразу 
после добавления препарата измеряли рН внутриклеточного 
раствора. Конечная концентрация |К+] после добавления гликлазида была равна 140 ммоль/л. Участки мембраны через определенные интервалы на протяжении эксперимента погружали в 
раствор Mg АТФ в концентрации 1 ммоль/л для восстановления 
потенциала в каналах. 

Снижение проводимости вычисляли при проведении линии 
между проводимостью с электрическим потенциалом при -20 мВ 
и потенциалом при -100 мВ; рассчитано среднее значение пяти 
последовательных изменений потенциалов в каждом растворе. 
Данные представлены как среднее значение ± 1 SEM. 

Кривая зависимости от дозы препарата рассчитывалась по 
формуле [9]: 

G 

= х-у, 
(1) 

Gc 
где G — проводимость при действии гликлазида, Gc — проводимость в контрольном растворе, 

х — термин, описывающий участок с высоким сродством, у 
— термин, описывающий участок с низким сродством. 
(1-L) 

х = L+ 
(2) 

(l+dGlicl/Kj,)"
1) 

(l+dGlicl/K^)
112), 
(3) 

где [Glic] — концентрация гликлазида; Kil, Ki2 — концентрация гликлазида, при которой ингибирование участков с высоким и низким сродством соответственно достигают значения, 
равного половине от максимального; hi, h2 — значения коэффициента Хилла для участков с высоким и низким сродством соответственно; L — проводимость, регистрируемая после того, как 
участки с высоким и низким сродством полностью заняты. В том 
случае, если имелся лишь один из двух участков, использовалась 
усеченная формула — G/Gc = х. 

Ф1 
13