ИНДУЦИРОВАННЫЙ ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Бесплатно
Основная коллекция
Издательство:
НИИ ноpмальной физиологии им. П.К. Анохина
Год издания: 2015
Кол-во страниц: 5
Дополнительно
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов
REFERENCES 1. Sherstnev VV, Gruden MA, Golubeva ON, Alexandrov Yu.I., Solovieva OA // Neurochemistry. 2015. T. 32. № 1. pp 19-26. 2. Cavanagh BL, Walker T, Norazit A, Meedeniya AC .// Molecules. 2011.- Vol.15, N16 (9) - P.7980-7993. 3. Zeng C., Pan F., Jones LA, Lim MM, Griffin EA et al. // Brain Res. 2010.- Vol. 1319 C.- P. 21-32. DOI:10.12737/12492 ИНДУЦИРОВАННЫЙ ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Шерчкова Т.А., Бурьянова Д.П., Машкина Е.В. Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия lenmash@mail.ru Ключевые слова: цитокины, культура лейкоцитов, полиморфизм генов, хемилюминесценция Цитокины как полипептидные продукты активированных клеток иммунной системы обеспечивают межклеточные взаимодействия. В основе механизма их действия лежит способность влиять на дифференцировку, пролиферацию и гибель клеток. Цитокины участвуют в сложной цепи нейроиммуноэндокринной регуляции гомеостаза и являются веществами с плейотропным действием. Уровень синтеза интерлейкинов (ИЛ) определяется многими факторами, в том числе и особенностями генотипа клеток по полиморфным вариантам генов про- и противовоспалительных цитокинов [1, 2]. В основе патогенеза многих патологических состояний лежит инициация свободно-радикальных реакций, приводящая к развитию окислительного стресса [3]. Интенсивность и продолжительность активности цитокиновой системы могут определять уровень окислительно-восстановительных реакций и характер течения патологических процессов. С другой стороны, уровень синтеза цитокинов зависит от особенностей генотипа клеток по аллельным вариантам генов цитокинов. Целью данной работы было исследование индуцированного воздействием Н2О2 профиля про- и противовоспалительных цитокинов в культуре лимфоцитов периферической крови человека с учетом генотипических особенностей клеток по аллельным вариантам генов цитокинов. Методика исследования. Материалом для исследования послужила цельная венозная кровь доноров мужского пола (11 человек). Клетки крови культивировали при 37оС на искусственной среде, которая содержала: питательную среду RPMI-1640, сыворотку крови человека, фитогемагглютинин. В качестве внешнего воздействия использовали 10 мМ Н2О2. Через 69 часов культивирования готовили препараты метафазных хромосом человека; культуральную жидкость использовали для определения уровня свободно-радикальных реакций (по величине быстрой вспышки и светосуммы хемилюминесценции). Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) определяли уровень ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10, а также фактора некроза опухоли (ФНО-α) в культуральной среде. Все измерения были проведены в трехкратной повторности. Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Манни-Уитни. Различия считали
статистически значимыми при P<0,05. Генотипы клеток по полиморфным вариантам генов исследуемых цитокинов (-31С-Т (rs1143627) IL-1β , 174G-C (rs1800795) IL-6, -592С-А (rs1800872), -819C-T (rs1800871) IL10, -308G-А (rs1800629) TNFα) определяли методом аллель-специфичной ПЦР. Результаты исследования. Размах индивидуальной изменчивости в уровне цитокинов в контрольных условиях достаточно высок. Однако для всех образцов культур клеток характерно равновесие между прои антиоксидантными компонентами, на что указывает положительная корреляция между уровнем быстрой вспышки хемилюминесценции и показателями светосуммы хемилюминесценции (r=0.908, p<0,05). Добавление в культуральную среду Н2О2. в концентрации 10 мМ сопровождается повышением уровня ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНОα в среде (в контроле 2895.2±230.6, 480.6±47.7 385,7±34,8 соответственно; при воздействии Н2О2 6507.2±521.6, 625.5±40.3 и 611,4±25,6 соответственно) (p<0,05). Однако необходимо отметить, что для ИЛ-10 и ФНОα отличия обнаружены только в подгруппе образцов культур клеток с низкими показателями концентрации данных соединений в контрольных условиях. Образцы культур клеток с высоким спонтанным уровнем ИЛ-10 и ФНОα не изменяют данный показатель в условиях наличия 10 мМ Н2О2. в культуральной среде. Для ИЛ6 отличия обнаружены только в подгруппе культур клеток с высокими исходными показателями концентрации ИЛ-6 в контроле. Таким образом, установлено, что образцы клеток, характеризующиеся генотип-обусловленным не высоким спонтанным уровнем ИЛ-10 и ФНОα, при воздействии 10 мМ Н2О2 реагируют повышением уровня данных цитокинов в культуре, что может свидетельствовать о формировании адаптивной ответной реакции клеток. В то же время клетки с изначально высоким уровнем индуцибельного ИЛ-6 характеризуются высокой восприимчивостью и усилением синтеза ИЛ-6 в присутствии Н2О2. Выявленные изменения в уровне цитокинов при внесении Н2О2. не вызывают развития окислительного стресса. Об этом свидетельствуют результаты исследования показателей люминол-зависимой хемилюминесценции. Высота быстрой вспышки и светосумма хемилюминесценции не отличаются от контрольных значений. Стимуляция синтеза цитокинов, прежде всего провоспалительных, при внесении в культуральную среду 10 мМ Н2О2 коррелирует с повышением пролиферативной активности лейкоцитов в культуре клеток. Клетки, характеризующиеся высоким уровнем пролиферации, имели генотип по гену IL6, соответствующий высокому уровню синтеза мРНК IL6. Анализ генотипических особенностей культивируемых клеток показал наличие ассоциации между наличием или отсутствием полиморфного варианта гена IL-10 и уровнем ИЛ-6 в культуральной среде. Наличие полиморфного варианта гена IL-10 коррелирует со снижением уровня ИЛ-6 в культуральной среде. Одна из основных функций ИЛ-10 заключается в ингибировании избыточного синтеза провоспалительных цитокинов. Полиморфные варианты генов цитокинов изменяют характер функционирования всей взаимосвязанной цитокиновой системы и обуславливают индивидуальный характер реакции клеток на внешнее воздействие. Таким образом, можно говорить о генотип-специфичном формировании ответной реакции клеток на внешние факторы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 6.98.2014/К). Литература 1. Annells M. F. et al. BMC pregnancy and childbirth. 2005. V. 5. №. 1. P 4. 2. Ferrari S. L. et al. J Clin End Met. 2003. V. 88. №. 1. P. 255-259. 3. Wilcox C. S. Am J Phys-Reg, Integrative Comparative Phys. 2005. V. 289. №. 4. P. 913-935. INDUCED CYTOKINE PROFILE IN HUMAN CELLS Sherchkova T.A. Buryanova D.P., Mashkina E.V. Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia lenmash@mail.ru Keywords: cytokines, lymphocytes, gene polymorphism, chemiluminescence It’s well-known that cytokines are polypeptide products of activated immune system cells and that they provide the cell-cell interactions. The mechanism of their action is based on the ability to affect the cellular differentiation, proliferation and death. Cytokines are involved in a complex system of neuroimmunoendocrine homeostatic regulation and have pleiotropic effects [1, 2]. Pathogenesis of many diseases is based on the initiation of free radical reactions by which oxidative stress may occur [3]. Intensity and duration of cytokine activity may determine cellular redox status and course of pathological processes. The purpose of this study was to investigate the Н2О2-induced proand anti-inflammatory cytokines profile in cultures of human peripheral blood lymphocytes in interrelation with such genotype features of cells as allelic variants of cytokine genes. Materials and methods. The experimental subjects were men to eliminate the influence of female hormones on the results cause it’s well-known that the concentration of cytokines in the blood is different depending on the phase of the menstrual cycle. Venous whole blood was used as material for the study. Blood cells were cultured at 37°C in an artificial medium which contained RPMI-1640 medium, human serum, phytohemagglutinin. 10 mM Н2О2 was used as an external adverse effect. After 69 hours of cultivation colchicine solution had been added to each bottle with mixture and preparations of human chromosomes in metaphase were made; the culture fluid was used to define a cellular redox state (by measuring of the quick flash intensity and the light sum of chemiluminescence). Concentration of IL-1β, IL-6, IL-10 and tumor necrosis factor (TNF-α) in the culture medium was measured by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). All experiments were repeated three times, and the results are expressed as the mean. Statistical evaluation was performed by means of the Mann-Whitney test. Difference were considered statistically significant at P<0.05. Allelic variants of cytokine genes (-31С-Т (rs1143627) IL-1β, -174G-C (rs1800795) IL-6, -592С-А (rs1800872), -819C-T (rs1800871), -1082G-A
(rs1800896) IL-10, -308G-А (rs1800629) TNFα) were identified by using allele-specific PCR. Amplification products were analyzed by horizontal electrophoresis in 3% agarose gel. Results. The scope of individual differences in the concentration of cytokines in control conditions is quite high. However, for all samples, in cell cultures, we have balance between pro- and antioxidant components, it’s indicated by the positive correlation between the quick flash intensity and light sum of chemiluminescence sum (r = 0.908, p <0,05). Addition of Н2О2 at a concentration of 10 mM to the culture medium increased concentration of IL-6 and ТNFα in fluid medium in comparison with control (p <0,05). It can tell about strengthening of inflammatory and immunomodulatory effects in response to the external adverse effect. However, it should be noted that for IL-10 and TNFα differences have only been found in a subset of samples from cell cultures with low concentrations of these compounds in the control conditions. Samples of cell cultures with a high spontaneous consentration of IL-10 and TNFα don’t have any statistically significant differences after addition of Н2О2 at a concentration of 10 mM to the culture medium in comparison with control conditions. For IL6 differences were found only in a subset of cell cultures with a high baseline concentration level of IL-6 in the control. Thus, it was found that cells which had a genotype-caused a spontaneous low level of IL-10 and TNFα increased synthesis of these cytokines in mediums after addition of Н2О2 at a concentration of 10 mM, which may indicate the formation of an adaptive reaction of lymphocytes in response to the external adverse effect. At the same time, cells with a high baseline concentration level of IL-6 had a high susceptibility and increased synthesis of IL-6 in the presence of Н2О2. The revealed changes in the level of cytokines after the influence of Н2О2 didn’t cause oxidative stress. It was confirmed by the results of research of luminol-dependent chemiluminescence. The height of the quick flash and the light sum of chemiluminescence didn’t differ from the control values. Thus, it was found that cells which had a genotype-caused a spontaneous low level of IL-10 and TNFα increased synthesis of these cytokines in mediums after addition of Н2О2 at a concentration of 10 mM, which may indicate the formation of an adaptive reaction of lymphocytes in response to the external adverse effect. At the same time, cells with a high baseline concentration level of IL-6 had a high susceptibility and increased synthesis of IL-6 in the presence of Н2О2. The revealed changes in the level of cytokines after the influence of Н2О2 didn’t cause oxidative stress. It was confirmed by the results of research of luminol-dependent chemiluminescence. The height of the quick flash and the light sum of chemiluminescence didn’t differ from the control values. The analysis of genotypic features of cultured cells showed the association between the presence or absence of a polymorphic variant of the gene -592С-А (rs1800872) IL-10 and level of IL-6 in culture medium. It’s well-known that one of the main functions of IL-10 is inhibiting an excessive synthesis of pro-inflammatory cytokines. According to this
work presence of the polymorphic variant IL-10 gene correlates with decreasing IL-6 concentration in the culture fluid. Polymorphic variants of cytokine genes change the functioning of the interconnected and interdependent cytokine system and determine the individual character of the cell reaction to external stimuli. Thus, we can tell about the formation of a genotype-specific response of cells to external factors. This study was supported by the federal assignment № 6.98.2014/К from Russian Ministry of Science and Education. References. 1. Annells M. F. et al. BMC pregnancy and childbirth. 2005. V. 5. №. 1. P 4. 2. Ferrari S. L. et al. J Clin End Met. 2003. V. 88. №. 1. P. 255. 3. Wilcox C. S. Am J Phys-Reg, Integrative Comparative Phys. 2005. V. 289. №. 4. P. 913. DOI:10.12737/12493 РИТМИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГОДОВОЙ ДИНАМИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕЧЕНИ КРЫС В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ Е.С. Шилкина, Т.А. Замощина Филиал «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии Федерального государственного бюджетного учреждения «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико биологического агентства», Томск glualena@yandex.ru Токсическое воздействие тетрахлорметана на крыс сопровождалось формированием десинхроноза между ритмами годовых динамик показателей печеночных проб, отражающих степень выраженности токсического поражения печени. Десинхронизация ритмики сохранялась на протяжении более двух недель. На 44 сутки после токсического воздействия отметили нормализацию некоторых показателей, однако не наблюдали полной ресинхронизации годовых ритмов. Ключевые слова: ритмы, печень, тетрахлорметан. Сезонные биоритмы организма являются важнейшим инструментом его адаптации к окружающей среде. Экологическая нагрузка в виде промышленных загрязнений является фактором, вызывающим напряжение адаптивно-компенсаторных возможностей организма, в том числе и его ритмической организации. Целью настоящего исследования явилось изучение ритмической структуры годовой динамики функциональных показателей печени крыс в условиях токсической нагрузки. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проведены на 656 крысах-самцах линии Вистар массой 250-350 г. Эксперименты не проводились в дни с резкими погодными колебаниями. При проведении исследований общая группа животных была разделена на серии: 1 серия – 288 интактных животных, 2 серия – 384 животных с токсическим воздействием тетрахлорметана. Тетрахлорметан (50 % масляный раствор из расчета 0,45 мл раствора на 100 г массы тела животного)