Метаболиты аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов и их роль в почвах

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ 

АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

АГРОНОМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Н.Н. НАПЛЕКОВА

МЕТАБОЛИТЫ АЭРОБНЫХ 

ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗРУШАЮЩИХ 

МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ РОЛЬ В ПОЧВАХ

Ответственный редактор

доктор биологических наук, профессор, заслуженный 

деятель науки РФ Р.А. Цильке

НОВОСИБИРСК 2010

УДК 631.461.61 (571.1)
ББК 40.325.1 (253.3)
 Н 273

Р е ц е н з е н т ы:

доктора биологических наук Н.В. Семендяева, 

О.А. Пасько

Утверждена и рекомендована к изданию ученым советом агрономиче
ского факультета НГАУ (протокол № 7 от 15 июня 2010 г.)

Наплекова Н.Н.

Н 273 Метаболиты аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов и их роль в почвах /Н.Н. Наплекова; Новосиб. гос. аграр. ун-т. – Новосибирск, 2010. – 228 с.: 19 ил., 
89 табл. – Библиогр.: 194 назв.

ISBN 978-5-94477-096-7

Монография посвящена изучению аминокислот, витаминов, фер
ментов, фенольных соединений, пигментов и слизей, синтезируемых 
целлюлозолитическими микроорганизмами, и их роли в процессе гумусообразования и формирования почвенной структуры.

Книга рассчитана на микробиологов, экологов, почвоведов, агро
химиков и агрономов.

УДК 631.461.61 (571.1)
ББК 40.325.1 (253.3)

Naplekova N.N. Metabolite of the aerobic cellulolitic mi
croorganisms and their function in a soils. – Novosibirsk, 2010. 
– 228 с.

The monograph is dedicated to the study aminoacids, vitamins, 

ferments, phenolic connection, pigments and slime, whith of the cellulosolitic 
microorganisms sintesed and their function in a soils.

The monograph is intended for microbiologovs, ecologists, pedologists, 

agrochemists, agronomists.

Tabl. 89. Ill. 19. Ref. 194 entries.

© Н.Н. Наплекова, 2010
©  Новосибирский государственный
аграрный университет, 2010
ISBN 978-5-94477-096-7

ВВЕДЕНИЕ

Органическое вещество почв, являясь аккумулятором 

солнечной энергии, оказывает непрерывное воздействие 
на растения. Характер этого влияния определяется присутствием в его составе биологически активных веществ, которые могут быть как органическими соединениями индивидуальной природы, так и специфическими гумусовыми 
веществами.

Среди веществ индивидуальной природы особое значе
ние имеют витамины, аминокислоты, ферменты, токсины, 
антибиотики, ростовые вещества – ауксины, гиббереллины, 
ингибиторы. Указанные соединения непрерывно поступают 
в почву с корневыми выделениями растений, с наземными 
и корневыми растительными остатками, с органическими 
удобрениями.

Клетчатка составляет основную массу растительных 

остатков. Отсюда можно предполагать, что роль целлюлозоразрушающих микроорганизмов как продуцентов биологически активных веществ, пополняющих общий фонд этих 
соединений в органическом веществе почв, исключительно 
велика. Доказательством тому служат имеющиеся единичные сведения, показывающие образование отдельными 
видами целлюлозоразрушающих микроорганизмов аминокислот, витаминов и окислительных ферментов, участвующих в процессе гумификации. Сведения о способности этих 
микроорганизмов синтезировать ростовые вещества отсутствуют. Это, а также малая изученность синтеза ими перечисленных выше соединений и послужило основанием для 
выяснения роли целлюлозоразрушающих микроорганизмов 
в процессе аккумуляции биологически активных веществ в 
почве.

Почва имеет  неограниченное количество источника 

энергии для развития целлюлозоразрушающих микроор

ганизмов. Это  позволяет предположить, что удельный вес 
этой группы микроорганизмов в общем синтезе биологически активных веществ в почве будет более значителен по 
сравнению с микроорганизмами, развитие которых постоянно лимитируется недостаточным содержанием легкодоступных органических веществ и в значительной мере определяется интенсивностью процесса разложения целлюлозы.

Для того, чтобы судить о физиологических особенно
стях целлюлозоразрушающих микроорганизмов, населяющих почвы Западной Сибири, необходимо было сопоставление целлюлозолитической активности и их способности 
к накоплению биологических активных веществ в почвах 
разных регионов.

С этой целью выявление активных продуцентов этих со
единений среди целлюлозоразрушающих микроорганизмов 
проводили одновременно в почвах Западной Сибири, Восточной Сибири и Туркмении.

Как  известно, при разложении целлюлозы микроорга
низмы выделяют значительное количество слизи, участвующей в структурировании почвы, а также пигментов разнообразной природы, принимающих участие в синтезе гумусовых веществ, но эта способность их слабо изучена.

1. ПОДХОДЫ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ 

МЕТАБОЛИТОВ БАКТЕРИЙ

1.1. Разработка способа дифференцированного учета 
биологически активных веществ, выделяемых корнями 
растений и синтезируемых микроорганизмами (способ 

преодоления «микробного барьера»)

Микроорганизмы синтезируют и выделяют в субстрат 

разнообразные продукты метаболизма. Их состав и количество определяются характером взаимовлияния растений и 
микроорганизмов. Растения выделяют через корневую систему минеральные и органические соединения, которые 
являются источником питания для микроорганизмов. Количество и состав корневых выделений зависят от фазы развития растений и воздействия на растение условий внешней 
среды: освещенности, аэрации, влажности, рН и др.

Известно, что растения выделяют корнями уксусную, 

муравьиную, щавелевую кислоты, сахара, аминокислоты, 
витамины группы В и другие соединения [1, 2]. В литературе существует уже достаточное количество сведений о методах получения корневых выделений древесных пород и 
различных травянистых растений [3]. Разработана методика 
получения корневых выделений в стерильных условиях у 
бобов [4]. Для древесных пород предложена методика получения корневых выделений в водной, песчаной культурах и 
в естественных условиях [3].

Для получения корневых выделений дикорастущих тра
вянистых растений и культурных злаков в естественных условиях эти методы неприемлемы. Что касается определения 
метаболитов, то ни один из имеющихся методов не позволяет разделить метаболиты корневых выделений и микроорганизмов, развивающихся на корнях. В силу этого потребовалась разработка специального метода определения состава 

корневых выделений, позволяющего преодолеть «микробный барьер» на корнях растений.

С этой целью корневые выделения растений в природ
ных условиях получали таким образом. Верхнюю часть одного из боковых корней осторожно очищали от почвы, но 
так, чтобы его растущая (нижняя) часть не теряла связи с 
почвой. Затем освобожденную часть корня стерилизовали 
сначала стерильной водой, затем 2%-м раствором перекиси 
водорода или 5%-м раствором фенола с последующим промыванием стерильной водой. Использованную воду удаляли от корней растений по желобку, сделанному из плотной 
бумаги.

Проведенная стерилизация позволила получить отно
сительно стерильную поверхность корней растений, но, как 
показали высевы с обработанных корней в конце опыта, 
полностью преодолеть «микробный барьер», через который 
проходят корневые выделения растений, все же не удалось.

После стерилизации корня средний участок его был 

обернут стерильной полоской хроматографической бумаги, 
вырезанной по размеру корня, а с поверхности бумага закрывалась стерильным целлофаном. В таком виде корень 
вновь закрывали почвой. Через определенное время корень 
откапывали, снимали с него хроматографическую бумагу, 
повторно стерилизовали корень и обертывали новой бумагой. Такие операции повторяли несколько раз за вегетационный период под одним и тем же растением. В некоторых 
случаях, там, где корни были сильно подрыты и повреждены 
и имели слабую связь с почвой, растение желтело, гибло и 
для опыта приходилось брать другие повторности растений.

В лаборатории из хроматографической бумаги дистилли
рованной водой экстрагировали корневые выделения и в них 
химическими реакциями и методом хроматографии определяли содержание сахаров, аминокислот, органических кислот, витаминов группы В, ауксинов и гиббереллинов.

1.2. Определение продуцентов свободных 

аминокислот

Чтобы определить долю участия целлюлозоразрушаю
щих микроорганизмов в накоплении свободных аминокислот в почве, необходимо было учесть содержание активных 
продуцентов аминокислот среди микроорганизмов, выделяемых на различных питательных средах. С этой целью высев из почвенной суспензии делали на мясо-пептонный агар 
(МПА), крахмало-аммиачный агар (КАА), подкисленную 
среду Чапека и среду Гетчинсона с фильтровальной бумагой.

Продуценты свободных аминокислот учитывали по 

методике Н.М. Вербиной [5]. После подсчета микроорганизмов на поверхность колоний в чашках Петри на всех 
средах раскладывали целлофановые круги и на них круги 
хроматографической бумаги марки С Ленинградской фабрики № 2. Бумагу на целлофане плотно прижимали шпателем к поверхности колоний. Через 3 ч бумагу снимали, 
подсушивали и проявляли 0,5%-м раствором нингидрина в 
ацетоне. После прогрева между горячими стеклами в шкафу 
при 105оС проводили учет колоний, давших большие пятна 
аминокислот. Следует оговориться, что учет продуцентов 
оказался возможным лишь тогда, когда на чашках вырастало не более 40-60 колоний. В этом случае зоны проявления 
аминокислот были хорошо изолированы. Для количественного учета аминокислот, накопленных микроорганизмами 
на разных средах, аминокислоты после проявления их на 
фильтре извлекали спиртом (на 1 г фильтра 25 мл 75%-го 
спирта) и интенсивность окраски измеряли на ФЭК.

Для выявления способности синтезировать аминокис
лоты чистыми культурами целлюлозоразрушающих микроорганизмов их выращивали на жидкой среде Гетчинсона с 
фильтрами на поплавках [6], а бактерии-спутники – на этой 
же среде с 0,3; 1 и 2 % глюкозы. Опыты ставили в кониче

ских колбах на 100 мл, содержащих 30 мл среды. Инкубировали при 26-28оС. Затем биомассу отделяли (фильтрацией 
через плотный фильтр или центрифугированием в течение 10 
мин при 14 тыс. об./мин). Полученный фильтрат выпаривали 
досуха на водяной бане, добавляли 1 мл 75%-го этилового 
спирта и определяли качественный состав аминокислот, используя метод восходящей или нисходящей хроматографии 
на бумаге. Для разгонки аминокислот использовали систему 
растворителей, включающую бутанол, уксусную кислоту и 
воду (4:5:1). Длительность разгонки – 16 ч. Разгонка проводилась 3 раза. Проявляли хроматограммы 0,5%-м раствором 
нингидрина в ацетоне, изуком и изацетоном. Наиболее отчетливые результаты получены с изацетоном и нингидрином.

Идентификацию аминокислот проводили по метчикам 

аминокислот, проявленным одновременно и с испытуемой 
пробой, и по величине Rf.

Общее количество аминокислот, образуемых микро
организмами, учитывали в отдельных опытах. Отцентрифугированный фильтрат досуха выпаривали в фарфоровой 
чашечке. Осадок в горячей чашке сразу же обрабатывали 
раствором нингидрина, доводили 75%-м спиртом до объема 
25 мл и колориметрировали на ФЭК. Стандартную кривую 
для количественного определения аминокислот строили по 
лейцину [7].

1.3. Определение витаминов и биомассы 
целлюлозоразрушающих микроорганизмов

1.3.1. Качественное определение витаминов

Способность целлюлозоразрушающих микроорганиз
мов синтезировать витамины определена у культур, выращенных на жидкой среде Гетчинсона с фильтрами. Среду 
доводили до кипения, осадок отфильтровывали. После сте

рилизации фильтры заражали 5-суточной культурой бактерий или 7-суточными культурами грибов и актиномицетов. 
Через 7, 15, 18 и 30 дней культивирования микроорганизмов при 26-28оС в культуральной жидкости и в фильтрате 
определяли наличие витаминов. Для получения фильтрата 
клетки отделяли на центрифуге типа ЦЛН-2 при 6000 об./
мин в течение 20 мин.

Витамины определяли качественно по интенсивности 

роста индикаторных культур, учитываемой нефелометрически. Это дало возможность весь большой набор культур 
целлюлозоразрушающих микроорганизмов, имеющихся у 
нас в коллекции, разделить на активные и слабые продуценты витаминов и у активных культур определить синтез витаминов количественным методом.

Учет числа продуцентов витаминов среди микроорга
низмов, выросших на разных средах при посеве почвенной 
суспензии, и определение содержания витаминов в корневых 
выделениях растений проводили методом блоков [8], выращивая индикаторные культуры на агаризованных средах.

1.3.2. Количественное определение витаминов

Продуктивность синтеза витаминов микроорганизма
ми, разрушающими клетчатку, определяли также после выращивания их а жидкой среде Гетчинсона с фильтрами. В 
одной серии опытов выясняли влияние различных источников азота на синтез витаминов микроорганизмами. Источники азота вносили из расчета 0,25 г азота на 1 л среды. В 
другой серии опытов изучали влияние источников углерода 
на накопление витаминов микроорганизмами, которые вносили из расчета 5 г на 1 л среды. Витамины определяли в 
среде и в клетках [9]. Для более полного извлечения их из 
биологического комплекса культуральную жидкость или ее 
фильтрат предварительно обрабатывали. При определении 
кобаламина (В12), пиридоксина (В6), тиамина (В1) и нико

тиновой кислоты (В5) проводили кислотный гидролиз. При 
определении биотина (В7), инозита (В8) и пантотеновой кислоты (В3) клетки подвергали автолизу при 48оС 2-3 сут.

Кобаламин выявляли жидким методом [10] с посевом 

индикаторной культуры на минеральной среде, остальные 
витамины – общепринятым микробиологическим методом 
с применением индикаторных культур [11-15].

В качестве индикаторных культур использовали штам
мы, полученные из Института микробиологии АН СССР. Для 
определения тиамина использовали культуру Pichia fermentans Lodder шт. ВКМ-у-296; для пиридоксина и пантотеновой кислоты – Saccharomyces Ludwigii КМ шт. ВКМ-у-1167; 
для инозита – Torulopsis dattila шт. 375; для биотина – Candida tropicalis шт. СК-4; для кобаламина – Escherichia coli шт. 
ВКМ-В-60. Опыты, связанные с определением витаминов, 
проводили в посуде, обработанной хромовой смесью.

Содержание витаминов в клетках устанавливали по раз
ности их в культуральной жидкости и в фильтрате, а по накоплению их в фильтрате судили о способности микроорганизмов выделять витамины в среду.

Синтетическая среда Гетчинсона, на которой выращива
ли микроорганизмы, витамины не содержит.

Опыты ставили в трех повторностях. Аналитические 

определения каждой повторности опыта – трехкратные. Все 
полученные результаты достоверны. Колебания в повторностях были незначительны, и средняя ошибка опыта составляла 5%.

1.3.3. Определение биомассы микроорганизмов

Биомассу микроорганизмов, накапливающуюся на сре
дах с глюкозой и крахмалом, переносили из центрифужных 
пробирок на часовое стекло, высушивали до постоянной 
массы и взвешивали. На среде с фильтровальной бумагой 
определить количество биомассы весовым методом невоз