НЕЙРОГЕНЕЗ В ЗРЕЛОМ МОЗГЕ МЫШЕЙ C57BL/6: СРАВНИТЕЛЬНОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МАРКЕРОВ СИНТЕЗА ДНК BrdU И EdU

НЕЙРОГЕНЕЗ В ЗРЕЛОМ МОЗГЕ МЫШЕЙ C57BL/6: СРАВНИТЕЛЬНОЕ 

РЕГИОНАЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МАРКЕРОВ СИНТЕЗА ДНК BrdU И EdU

В.В.Шерстнев, А.К. Нанаев, М.А. , Грудень

ФГБНУ« НИИ нормальной физиологии  им.П.К. Анохина»

m.gruden@nphys.ru

Проведено 
сравнительное 
исследование 
региональных 
особенностей 

нейрогенеза на срезах зрелого мозга методами иммунофлюоресценции и/или 
химической детекции 2-х аналогов тимидина BrdU и EdU при их раздельном 
и 
совместном 
внутрибрюшинном 
введении 
мышам
C57BL/6. 
Получены 

результаты, свидетельствующие об эффективности использования EdU
для 

экспериментального изучения постнатального нейрогенеза.
Ключевые слова:
зрелый мозг, нейрогенез, маркеры пролиферации, BrdU, 

EdU, мыши.
В 
современных 
исследованиях 
постнатального 
нейрогенеза 
широко 

используютсинтетический аналог тимидина -5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU, 
применение которого имеет ряд существенных ограничений [2]. В этой 
связи, особый интерес вызывает использование другого аналога тимидина5ethynyl-2'-deoxyuridine, 
EdU, 
обладающего 
более 
высокой 

чувствительностью, а также выявления метки с помощью быстро протекающей 
химической 
реакции, 
не 
требующей 
применения 
моноклональных 
или 

поликлональных антител, что существенно повышает эффективность детекции 
и количественной оценки пролиферирующих клеток в зрелом мозге [3]. 
Однако, 
сравнительного 
исследования 
по 
количественной 
оценке 

пролиферирующих клеток в структурах зрелого мозга помимо зубчатой 
извилины гиппокампа с помощью BrdU и/или EdU не проводилось. Целью 
работы 
явилось 
проведение 
сравнительного 
количественного 
анализа 

распределения маркеров синтеза ДНК BrdU
и EdU
в пролиферирующих 

клетках различных структур зрелого мозге в условиях раздельного и 
совместного системного введения маркеров мышам.
МЕТОДИКА  ИССЛЕДОВАНИЯ 
Эксперименты выполнены на половозрелых мышах-самцах линии C57BL/6 весом 
26 -28 г (n=40) с соблюдением этических норм работы с лабораторными 
животными
в  соответствии с принципами гуманности,  изложенными в 

директиве Европейского сообщества (86/600 ЕС). Для оценки выявляемости 
BrdU
(Sigma, USA) и EdU
(Invitrogen, USA) использовали подобранную 

экспериментально (n=10) оптимальную дозу маркеров (150 мг/кг/в 50 мкл 
0,9 % NaCl)
при их индивидуальном (n=20) или совместном (n=10) 

внутрибрюшинном введении. Контрольным животным (n=3) вводили 0,9 % 
NaCl. Через 1 или 7 суток мышей декапитировали, мозг замораживали в 
жидком азоте, хранили при -85°C. BrdU выявляли как описано ранее [1]. 
Химическую детекцию EdU
проводили по протоколу Click-iT™ EdU
Imaging

Kit (Invitrogen, USA). Подсчёт BrdU- и EdU- положительных клеток (BrdU+ 
и EdU+) проводили на 117 серийных срезах у каждого животного в отделах 
гиппокампа, коре мозга, черной субстанции, сосудистом
сплетении, 

стенках желудочков мозга и мозговой оболочке
(от-2.12 до -6.04 mm 

относительно Bregma). Визуализацию окрашенных срезов проводили на 
микроскопе OLYMPUS BX51 Reflected fluorescence system (Olympus,USA) и 

программы Viewfinder Lite (USA). Достоверность различий выявляли с 
помощью t-теста Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обнаружено, что EdU имеет в основном сходную с BrdU ядерную локализацию 
в клетках нейрогенных структур мозга в зубчатой извилине (ЗИ) 

гиппокампа и субвентрикулярной зоне (СВЗ) желудочков мозга. Так, через 
24 ч после индивидуального введения обоих меток в гиппокампе выявлено 
суммарно 4360,0±53,0 и 3523,0±47,0 EdU+ и BrdU+ клеток, соответственно. 
При этом, в ЗИ, в коре, в СВЗ количество  EdU+ клеток в 2,5, 1,55 и 1,8 
раза (p<0,05) превышает таковое у BrdU+ клеток, соответственно, В 
других изученных областях мозга документировано сопоставимое количество
EdU+ и BrdU+ клеток. При совместном введении меток через 24 часа 
выявлена конкуренцию встраивания меток в ДНК, снижение меченных клеток 
в гиппокампе и СВЖ на 50% (p<0,05), коре на 37%(p<0,05). Отмечена 
межполушарная 
асимметрия 
распределения 
EdU+ 
и 
BrdU+ 
клеток: 
в 

гиппокампе правого полушария наблюдалось суммарно на 18,9 % больше 
меченых клеток, чем в левом полушарии мозга. Обнаруженные особенности 
индивидуального и совместного количественного содержания  EdU+ и BrdU+ 
в частности, ЗИ согласуются в данными Zeng et.al., 2010 [3] 
Результаты 
проведенной 
работы 
документируют 
 
эффективность 

использования 
EdU для экспериментального исследования постнатального нейрогенеза.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Шерстнев В.В., Грудень М.А., Голубева О.Н., Александров Ю.И., 

Соловьева О.А. //Нейрохимия. 2015. Т. 32. № 1. С. 19-26.
2.
Cavanagh BL, Walker T, Norazit A, Meedeniya AC.// Molecules. 

2011.- Vol.15,N16(9)- P.7980-7993.
3.
Zeng C., Pan F., Jones L. A., Lim M. M., Griffin E. A. et al.  // 

Brain Res. 2010.- Vol. 1319 C.- P. 21–32.

MATURE BRAIN NEUROGENESIS IN C57BL/6 MICE: COMPARATIVE 

REGIONAL DISTRIBUTION OF THE DNA SYNTHESIS MARKERS BrdU AND 

EdU

V. V.Sherstnev, А.K. Nanaev, M. A. Gruden

P. K. Anokhin Research Institute of Normal Physiology

m.gruden@nphys.ru

Comparative study of neurogenesis regional features on mature brain 
slices by immunofluorescence techniques and/or chemical detection of 
the two thymidine analogues BrdU and EdU in their particular and dual 
intraperitoneal administration in C57BL/6 mice was peformed. The 
results indicate the effectiveness of the EdU usage for experimental 
study postnatal neurogenesis.
Keywords: adult brain, neurogenesis, proliferation markers, BrdU, EdU.
In recent studies of postnatal neurogenesis widely used synthetic 
thymidine analogue -5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU, the utilizing of 
which has a number of significant limitations [2]. In this regard, of 
particular interest is the employment of another thymidine analog as  

5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU, enclosing a higher sensitivity and 
label detection with a rapidly occurring chemical reaction that does 
not require the usage of monoclonal or polyclonal antibodies, which 
significantly increases the efficiency of detection and quantify the 
proliferating cells in mature brain [3]. However, a comparative study 
to quantify the proliferating cells in mature brain structures besides 
the dentate gyrus of the hippocampus using BrdU and/or
EdU was not 

conducted. The aim of the work was a comparative quantitative analysis 
of the marker of DNA synthesis BrdU and EdU distribution in 

proliferating cells of different mature brain structures in terms of 
particular or joint marker systemic administration in mice.
METHODS
The experiments were performed on adult male mice lines C57BL/6 mice 
weighing 26 -28 g (n =43) in compliance with the ethical standards of 
work 
with 
laboratory 
animals, 
in 
accordance 
with 
humanitarian 

principles set out in European Community Directive (86/600 EC). To 
assess the detectability of BrdU (Sigma, USA) and EdU (Invitrogen, USA) 
it was used experimentally matched (n =10) the optimum dose of markers 
(150 mg / kg/ 50 l of 0,9% NaCl) with their individual (n =20) or joint 
(n =10) intraperitoneal administration. Control animals (n =3) was 0,9% 
NaCl. After 1 or 7 days, mice were decapitated, the brain was frozen in 
liquid nitrogen, stored at -85 ° C. BrdU was detected as described 
previously [1]. EdU chemical detection was performed by protocol ClickiT ™ EdU Imaging Kit (Invitrogen, USA). Calculation of individual or 
joint BrdU- and EdU- positive cells (BrdU+ and EdU+) was achieved on 
117 serial sections from each animal in the hippocampus, cerebral 
cortex, substantia nigra, choroid plexus, the walls of the ventricles 
and the meninges (from 2.12 to -6.04, mm relative to the Bregma). 
Visualization of the stained sections was carried out microscopically 
using an OLYMPUS BX51 Reflected fluorescence system (Olympus, USA) and 
the Viewfinder Lite program (USA). Significant differences were 
detected by the Student t-test.
RESULTS
It was disclosed that EdU had basically similar to BrdU nuclear 
localization in cells of neurogenic brain structures - in the dentate 
gyrus (DG) of the hippocampus and the subventricular zone (SVZ). 
Twenty-four hours after BrdU & EdU individual administration the 
hippocampus revealed a total of 4360.0 ± 53.0 and 3523.0 ± 47.0 EdU+ 
and BrdU+ cells, respectively. Thus, EdU+ cells were found in the DG, 
cortex, SVZ
in amount higher 2,5, 1,55 1,8 times than BrdU+ cells 

(p<0,05), respectively. In other brain surveyed areas it was revealed a 
comparable amount between EdU + and BrdU + cells. When co-administered 
within 24 hours of labels identified competition embed tags in the DNA, 
in reducing the labeled cells in the hippocampus and the walls of the 
ventricles by 50% (p <0,05), the bark of a 37% (p <0,05). There was a 
hemispheric asymmetry of the EdU + and BrdU+ cell distribution: the 
right brain hemisphere displayed 18.9% more positive cells than the 
left hemisphere.The observed features of individual and combined 
quantitative content EdU + and BrdU + in particular in DG consistent 
data Zeng et.al., 2010 [3]. The results of this work documented the EdU 
efficiency for experimental study of postnatal neurogenesis.

REFERENCES
1.
Sherstnev VV, Gruden MA, Golubeva ON, Alexandrov Yu.I., Solovieva 

OA // Neurochemistry. 2015. T. 32. № 1. pp 19-26.
2.
Cavanagh BL, Walker T, Norazit A, Meedeniya AC .// Molecules. 

2011.- Vol.15, N16 (9) - P.7980-7993.
3.
Zeng C., Pan F., Jones LA, Lim MM, Griffin EA et al. // Brain Res. 

2010.- Vol. 1319 C.- P. 21-32.
DOI:10.12737/12492

ИНДУЦИРОВАННЫЙ ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ

В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Шерчкова Т.А., Бурьянова Д.П., Машкина Е.В.

Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия

lenmash@mail.ru

Ключевые слова: цитокины, культура лейкоцитов, полиморфизм генов, 
хемилюминесценция
Цитокины как полипептидные продукты активированных клеток иммунной 
системы обеспечивают межклеточные взаимодействия. В основе механизма их 
действия лежит способность влиять на дифференцировку, пролиферацию и 
гибель 
клеток. 
Цитокины 
 
участвуют 
в 
сложной 
цепи 

нейроиммуноэндокринной регуляции гомеостаза и являются веществами с 
плейотропным действием. Уровень синтеза интерлейкинов (ИЛ) определяется 
многими факторами, в том числе и особенностями генотипа клеток по 
полиморфным вариантам генов про- и противовоспалительных цитокинов [1, 
2]. В основе патогенеза многих патологических состояний лежит инициация 
свободно-радикальных реакций, приводящая к развитию окислительного 
стресса [3]. Интенсивность и продолжительность активности цитокиновой 
системы могут определять уровень окислительно-восстановительных реакций 
и характер течения патологических процессов. С другой стороны, уровень 
синтеза цитокинов зависит от особенностей генотипа клеток по аллельным 
вариантам генов цитокинов. Целью данной работы было исследование 
индуцированного воздействием Н2О2 профиля про- и противовоспалительных 
цитокинов в культуре лимфоцитов периферической крови человека с учетом 
генотипических особенностей клеток по аллельным вариантам генов 
цитокинов.
Методика исследования. Материалом для исследования послужила цельная 
венозная кровь доноров мужского пола (11 человек). Клетки крови 
культивировали при 37оС на  искусственной среде, которая содержала: 
питательную 
среду 
RPMI-1640, 
сыворотку 
крови 
человека, 

фитогемагглютинин. В качестве внешнего воздействия использовали 10 мМ 
Н2О2. Через 69 часов культивирования готовили препараты метафазных 
хромосом человека; культуральную жидкость использовали для определения 
уровня свободно-радикальных реакций (по величине быстрой вспышки и 
светосуммы хемилюминесценции). Методом твердофазного иммуноферментного 
анализа (ELISA) определяли уровень ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10, а также фактора 
некроза опухоли (ФНО-α) в культуральной среде. Все измерения были 
проведены 
в 
трехкратной 
повторности. 
Статистическую 
обработку 

результатов проводили, используя критерий Манни-Уитни. Различия считали