Фармакогенетика циклофосфамида

Л.Ю. телегин
фармакогенетика 
циклофосфамида
Монография
Москва
ИНФРА-М
2017

ФЗ 
№ 436-ФЗ
Издание не подлежит маркировке 
в соответствии с п. 1 ч. 2 ст. 1
УДК 615.454.2
ББК 52.81
 
Т31
Т31
Телегин Л.Ю.
Фармакогенетика циклофосфамида : монография. — М. : 
ИНФРА-М, 2017. — 78 с. — (Научная мысль).
ISBN 978-5-16-010343-3 (print)
ISBN 978-5-16-102312-9 (online)
В монографии рассмотрены вопросы, связанные с определениями основных понятий фармакогенетики и фармакогеномики. Подробно освещены самые разнообразные аспекты экспериментального исследования 
циклофосфамида – широко используемого противоопухолевого и иммуномодулирующего агента. Приведены результаты опытов, позволившие 
выявить главные маркёры чувствительности (устойчивости) к циклофосфамиду и обнаружить новый механизм иммунодепрессивного, токсического, антипролиферативного и мутагенного действия этого агента.
Для фармакологов, онкологов, иммунологов, преподавателей и студентов мединститутов.
УДК 615.454.2
ББК 52.81
ISBN 978-5-16-010343-3 (print)
ISBN 978-5-16-102312-9 (online)
© Телегин Л.Ю., 2012
Издано в авторской редакции
Подписано в печать 13.06.2016.
Формат 60×90/16. Печать цифровая. Бумага офсетная. Г
арнитура Newton. 
Усл. печ. л. 4,9. ППТ20. Заказ  № 00000
ТК 164950-600382-250811
Оригинал-макет подготовлен в НИЦ ИНФРА-М
ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М»
127282, Москва, ул. Полярная, д. 31В, стр. 1
Тел.: (495) 280-15-96, 280-33-86. Факс: (495) 280-36-29
E-mail: books@infra-m.ru        http://www.infra-m.ru
Отпечатано в типографии ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М»
127282, Москва, ул. Полярная, д. 31В, стр. 1
Тел.: (495) 280-15-96, 280-33-86. Факс: (495) 280-36-29

Памяти моих родителей, Прасковьи Ивановны Полянской
и Юрия Владимировича Телегина,
и рано ушедших Валентина Викторовича Рупасова,
Кира Николаевича Гринберга,
Владимира Георгиевича Черникова,
Георгия Фёдоровича Жирнова,
Бориса Константиновича Чернова,
Николая Владимировича Корчагина,
Марианны Викторовны Корчагиной,
Татьяны Владимировны Анфаловой
ПРЕДИСЛОВИЕ
Переосмысление молекулярных путей патогенеза и успехи в
разработке геномных технологий открыли новые горизонты для лечения
болезней и позволили разработать новые терапевтические подходы для
лечения каждого отдельного больного. Применение парадигмы персонифицированной медицины даст возможность поставить правильный
диагноз и применить правильное лечение для "правильного" больного в
"правильное время" и при правильных затратах. Именно таким образом
определяется главное значение персонифицированной медицины организаторами симпозиума "Персонифицированная медицина: принципы и
практика", который состоялся 1 марта 2011 года в США. По мнению
Kumar (2009) компонентами персонифицированной медицины являются
следующие разделы современной молекулярной медицины: изучение
фармакокинетики, фармакодинамики, фармакогенетика, фармакогеномика,
фармакопротеомика,
метаболомика,
визуализация
молекулмишеней, терапия стволовыми клетками, диагностическое тестирование
у постели больного и др. Фактически, главный принцип персонифицированной медицины – "лечить не болезнь, а больного" – был сформулирован знаменитым русским терапевтом Михаилом Яковлевичем Мудровым ещё в 1820 г. в книге "Слово о способе учить и учиться медицине
практической": "Я намерен сообщить вам новую истину, которой многие не поверят и которую, может быть, не все из вас постигнут. Врачевание не состоит в лечении болезни... Врачевание состоит в лечении
самого больного.… Каждый больной, по различию сложения своего,
требует особого лечения, хотя болезнь одна и та же" (цит. по А. Л. Мясников, 1951).  
Тема настоящего исследования тесно переплетается с одной из
ведущих задач Центра теоретических проблем физико-химической
3

фармакологии РАН – определение метаболического статуса человеческого организма (Л. А. Пирузян, 2004) для реализации принципа индивидуализации лекарственной терапии и, в частности, иммунодепрессивной терапии. Широкое использование иммунодепрессантов ставит перед клиницистами задачу оценить индивидуальную, наследственно обусловленную чувствительность (резистентность) к лекарственному воздействию. Очевидно, что для решения этой задачи, прежде всего, необходимы целенаправленные экспериментальные исследования.
Вопрос о значении наследственных факторов в определении
степени иммунодепрессии, возникающей под влиянием химиопрепаратов-иммунодепрессантов, ранее систематически исследовался экспериментальной группой лаборатории иммуногенетики Института медицинской генетики АМН СССР.
Всё началось с экспериментального факта, обнаруженного
Львом Алексеевичем Певницким в процессе работы над докторской
диссертацией (Л. А. Певницкий, 1974) – наличие межлинейных различий у мышей в степени лекарственно индуцируемой иммунологической
толерантности. Это состояние специфической иммунологической ареактивности (неотвечаемости) возникает в результате сочетанного введения в организм экспериментального животного огромной дозы антигена
(тем самым активируется весь иммунокомпетентный клон) и лекарственного препарата-иммунодепрессанта, приводящего к элиминации активированного антигеном клона клеток иммунной системы (так называемая, клональная форма толерантности, см. Л. Н. Фонталин и Л. А.
Певницкий, 1978). Данное состояние специфично – сохраняется полноценный иммунный ответ на другие антигены. Наилучшие результаты
были получены у мышей при использовании в качестве антигена эритроцитов барана (ЭБ), в качестве иммунодепрессанта – циклофосфамида
(ЦФ). Длительность состояния полученной таким образом иммунологической толерантности сохранялась до 1 года (почти половина мышиной
жизни).
Нами первоначально был изучен вопрос о существовании подобных межлинейных различий у мышей в степени подавления ЦФ
первичной иммунной реакции на оптимальную иммуногенную дозу ЭБ.
В широком диапазоне доз иммунодепрессанта мы выявили линии мышей, контрастно реагирующих на иммунодепрессивное воздействие:
BALB/cJLacSto (резистентная линия) и DBA/2JSto (чувствительная линия) (Л. А. Певницкий, Л. Ю. Телегин, В. Н. Большев, 1977). 
При анализе причин обнаруженных различий мы установили,
что иммунологические механизмы здесь играют подчинённую роль:
сопоставление нормальной реакции мышей разных генотипов на антиген и степени относительной иммунодепрессии показало, что между
этими параметрами связи нет. Так, например, при использовании ЭБ в
4

дозе 5×108 клеток высота иммунного ответа в контроле была практически одинаковой у мышей исследуемых линий, тогда как показатели относительной иммунодепрессии существенно различались. Следует также отметить, что гены комплекса H-2, по-видимому, не определяют
чувствительность (резистентность) к препарату, поскольку мыши контрастных генотипов BALB/c и DBA/2 имеют одинаковый H-2-гап-    
лотип 
– 
H-2d 
(http://jaxmice.jax.org/strain/000651.html
и
http://jaxmice.jax.org/strain/000671.html). Причину межлинейных различий при иммунодепрессии и иммунологической толерантности следовало
искать
в
особенностях
поведения
лекарственного
препаратаиммунодепрессанта в организме мышей разных генотипов.
Мы исследовали (Л. Ю. Телегин, 1981) следующие маркёрные
признаки фармакокинетики и фармакодинамики ЦФ в организме мышей разных линий: особенности метаболизма ЦФ в микросомах клеток
печени; фармакокинетику содержания в сыворотке крови активных алкилирующих метаболитов ЦФ; иммунодепрессивное действие на тестклетки ЦФ, активированного in vitro ("активный" постмикросомальный
супернатант) и in vivo ("активная сыворотка"); чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к иммунодепрессивному влиянию
"активной сыворотки".
В результате проведённых исследований было установлено, что
для мышей "резистентного" генотипа BALB/c по сравнению с мышами
"чувствительной" линии DBA/2 была характерна более высокая скорость метаболизма ЦФ в печени, большее содержание активных алкилирующих метаболитов в крови, но меньшая чувствительность иммунокомпетентных клеток-мишеней селезёнки. В процессе проведения опытов был обнаружен ранее неизвестный факт отсутствия параллелизма
между содержанием активных алкилирующих продуктов метаболизма
ЦФ в образцах "активной сыворотки" и её иммунодепрессивным действием в отношении тест-клеток. Тогда была высказана гипотеза, объясняющая это явление, – усиление интактным ЦФ действия своих активных метаболитов – и она нуждалась в экспериментальной проверке.
Циклофосфамид (ЦФ) является классическим цитостатическим
препаратом, обладающим мощным противоопухолевым действием и
выраженной иммуномодулирующей активностью. Клиническая эффективность препарата была многократно подтверждена при терапии опухолей (Loeffler et al., 2005; Emadi et al., 2009), трансплантации костного
мозга и лечении ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний (http://www.xpharm.com/citation?Article_ID=8220). Потенциальные области применения ЦФ для лечения заболеваний за последние
годы существенно расширились благодаря экспериментальному обоснованию его применения при суицидной генотерапии опухолей (Hedley 
et al., 2007) и для подавления активности регуляторных Т-клеток, инги5

бирующих развитие иммунных реакций при иммунотерапии рака (Thistlethwaite et al., 2008). 
В настоящей монографии помимо данных литературы об этом
препарате и сведений о некоторых других иммунодепрессантах мы
представим результаты собственных экспериментов, посвящённых изучению фармакогенетических аспектов иммунодепрессивного и токсического действия ЦФ и открытию нового механизма действия этого агента.
Автор выражает сердечную благодарность моему "научному
отцу" – профессору Льву Алексеевичу Певницкому. Он научил меня
основным навыкам экспериментальной работы, привил этические принципы научной деятельности, научил методам обработки научных результатов, как правильно их подготовить для опубликования. Я ему
благодарен безмерно. Я благодарен профессору Вячеславу Михайловичу Девиченскому, профессору Владимиру Митрофановичу Писареву и
канд. биол. наук Татьяне Александровне Сидоровой: их вклад в токсикологические исследования циклофосфамида и экспериментальную
проверку гипотезы усиления циклофосфамидом действия собственных
активных метаболитов поистине бесценен. Хочу поблагодарить моих
коллег, друзей и товарищей, которые тем или иным образом помогали
мне в работе над данной книгой: Веремко Лесю Николаевну, Викторова
Виктора Владимировича, Голову Юлию Борисовну, Девиченскую Валентину Александровну, Ермакова Алексея Васильевича, Ерофееву
Ольгу Романовну, Жирнова Георгия Фёдоровича, Ким Нам Ира, Корневу Елену Николаевну, Корчагина Николая Владимировича, Косякову
Надежду Валериевну, Лещинскую Ирину Петровну, Лильп Ирину Германовну, Мазурова Алексея Владимировича, Морозову Наталью Николаевну, Павличенко Светлану Николаевну, Платонову Валерию Ивановну, Поспехову Наталью Ивановну, Пухальскую Веру Георгиевну,
Ремизова Вячеслава Ивановича, Смирнову Нелли Николаевну, Хаспекову Светлану Георгиевну, Чеботарёва Александра Николаевича, Черникова Владимира Георгиевича, Чернова Бориса Константиновича,
Чичкова Анатолия Николаевича, Шипулину Алину Фёдоровну, Шмидт
Елену Феликсовну, Яковенко Константина Николаевича.
6

Глава 1. 
ФАРМАКОГЕНЕТИКА И ФАРМАКОГЕНОМИКА
В августе 2004 г. были завершены работы по расшифровке генома человека (ENCODE Project Consortium, 2004). На основе сведений
о структуре и функции тех или иных генов и благодаря внедрению новейших молекулярно-биологических методов возникли новые направления биологии и медицины – геномика, транскриптомика, протеомика,
фармакогеномика, токсикогеномика, метаболомика, гликомика и т. д.
Завершение проекта "Геном человека" дало возможность более полно
охарактеризовать роль генетических факторов в степени чувствительности (резистентности) к лекарственному воздействию, определяющей
терапевтическую эффективность применяемого медикамента и его токсические и побочные эффекты.
Согласно документу Европейского агентства лекарств (European Medicinal Agency, EMEA, http://www.ema.europa.eu) от 25 мая            
2007 г. фармакогенетика – это область исследований межиндивидуальной изменчивости генов транспорта лекарств, генов ферментов лекарственного метаболизма, генов мишеней действия лекарств, обусловливающей терапевтическую эффективность или побочное действие лекарства.
Фармакогеномика изучает особенности поведения лекарства в
организме и реакцию на лекарственное воздействие с учётом всей генетической информации. Reid (2008) даёт следующее определение фармакогеномики – это "использование информации о геноме, транскриптоме,
протеоме, метаболоме и энвироме для создания лекарства и его клинического применения, и отражает состояние реакции на лекарство на
клеточном, тканевом, организменном и популяционном уровне". Здесь
следует пояснить термин "энвиром" или "энвиромика". Понятие "энвиромика" первоначально появилось в эпидемиологии психиатрических
болезней и рассматривалось как область исследований единого множества внешнесредовых факторов, влияющих на появление расстройств
психики и поведения (Anthony, 2001). Применительно к фармакогенетике и фармакогеномике энвиромика – это совокупность внешнесредовых
факторов (физические факторы, образ жизни, социальные стрессы, демографические факторы, особенности питания, ксенобиотики, включая
токсины и патогены), которые могут повлиять на терапевтическую эффективность лекарства или привести к развитию заболевания.
Очевидно, что понятие "фармакогеномика" – это сложный для
исследования процесс. Видимо, поэтому ведущие специалисты в области медицинской генетики David Gurwitz и Arno G. Motulsky (2007) 
предпочитают использовать при описании судьбы лекарства в организме "более содержательный и конкретный термин – фармакогенетика".
7

Взаимодействие лекарства с организмом – непрерывный во
времени процесс – условно разделяют на фармакокинетику и фармакодинамику (рис. 1).
Рис. 1. Схема путей лекарства в организме
Рассмотрим вкратце параметры фармакокинетики и фармакодинамики.
После введения лекарства в организм (перорально, сублингвально, ингаляционно, внутримышечно, внутривенно, подкожно или
per rectum) оно достигает системного кровотока и через портальную
вену попадает в печень, где преимущественно происходит его метаболическая модификация с помощью ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК). ФБК также представлены (Abou-Donia et al., 2002), 
но в меньшем количестве в лёгких, почках, кишечнике (среднее содержание ФБК), коже, семенниках, плаценте, надпочечниках (низкое содержание), тканях нервной системы (очень низкое). Реакции БК разделяются на две фазы: фаза I – окисление, восстановление, гидролиз,
изомеризация, гидратация, циклизация; фаза II – глюкоронирование,
гликозилирование, сульфатирование, метилирование, ацетилирование,
конъюгирование с аминокислотами, конъюгирование с глутатионом,
конъюгирование с жирными кислотами, конденсация. Эти реакции катализируются следующими ферментами: фаза I – цитохром P450зависимые монооксигеназы, микросомальная флавинсодержащая монооксигеназа, алкогольдегидрогеназа, альдегиддегидрогеназа (альдегидоксидаза), ксантиноксидаза, аминоксидазы, ароматазы, алкилгидразиноксидаза; фаза II – УДФ-глюкоронилтрансфераза (глюкоронирование), УДФ-гликозилтрансфераза (гликозилирование), сульфотрансфера8

за (сульфатирование),
метилтрансфераза (метилирование),
ацетилтрансфераза (ацетилирование) и глутатион-S-трансфераза (конъюгирование с глутатионом). Характеристику ФБК, участвующих в метаболизме циклофосфамида (ЦФ) мы дадим позднее.
Взаимодействие с мишенью определяет фармакодинамику лекарственного средства, конечным итогом которой является собственно
реакция на лекарство – терапевтический эффект или токсическое действие, или развитие побочных реакций. В этом процессе могут принимать
участие рецепторы, белки-переносчики молекул лекарства или его метаболита, ионные каналы, молекулы клеточной адгезии, компоненты
сигнальных путей, шапероны, системы репарации нуклеиновых кислот
и белков, факторы пострансляционного процессинга, клеточного цикла,
ростовые и транскрипционные факторы (Nebert et al., 2008).  
Очевидно, что каждый из всего многообразия компонентов
фармакокинетики и фармакодинамики подвержен генотипической и
фенотипической изменчивости. Это обстоятельство объясняет скепсис
ведущих фармакогенетиков мира, Вернера Калова и Арно Мотульского,
в отношении скорого наступления "эры персональной медицины", несмотря на применение передовой методики определения однонуклеотидного полиморфизма (SNP-polymorphisms) для выявления полногеномных ассоциаций (genome-wide associations). Так, Калов (Kalow, 
2006) пишет, что "только по прошествии длительного времени при усовершенствовании полигенного тестирования можно будет говорить о
возрастании роли персональной медицины. Однако наличие многочисленных и сложных параметров фармакогеномики и, в особенности, наличие зависимых от времени изменений экспрессии генов, никогда не
позволят персональной медицине стать безошибочной". В уже цитированной статье Гурвица и Мотульского (2007), посвященной 50-летию со
дня опубликования статьи Мотульского (Motulsky, 1957), где впервые
было высказано предположение, что "наследственность может объяснить индивидуальные различия в лекарственной эффективности и появлении побочных реакций", говорится следующее: "Где находится фармакогенетика по прошествии 50 лет? Является ли диагностическое тестирование вариантов генов и/или ферментов, которые влияют на фармакокинетику или фармакодинамику, обычно используемой практикой
для принятия клинических решений? Являются ли фармакогенетические диагностические тесты открытыми к финансированию общественными и страховыми организациями, как это наблюдается в случае других медицинских тестов? И, что более важно, стала ли новая медицина,
по сравнению со старой, более эффективной и безопасной благодаря
знаниям фармакогенетики при разработке лекарства и при их использовании в клинической практике? К сожалению, за небольшим исключением ответы на эти вопросы отрицательны…". Многие из указанных
9

трудностей можно избежать при проведении экспериментальных фармакогенетических исследований с использованием мышей инбредных
линий.
Глава 2. 
МЫШИ КАК ОБЪЕКТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ
ФАРМАКОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
По мнению Watters и McLeod (2002) лабораторные мыши инбредных линий являются идеальной модельной системой для изучения
фармакогенетических
закономерностей.
Во-первых,
негенетические
факторы, такие как поддержание светового дня, пищевой рацион и другие влияния внешней среды в условиях вивария можно строго контролировать и стандартизовать. Во-вторых, мыши имеют очень схожие с
человеком органы и ткани, которые только 80 млн. лет назад дивергировали от человека (Jorge-Nebert et al., 2007). Также известно (см., например, Н. А. Попова, 2000), что инбредные линии мышей получаются в
результате братско-сестринского скрещивания в течение 20 поколений.
В итоге все гены (кроме генов в половых хромосомах) у особей внутри
одной линии находятся в гомозиготном состоянии, и мыши генетически
идентичны как монозиготные близнецы. Такие генетические особенности линейных мышей позволяют при обнаружении фенотипических
межлинейных различий в реакции на лекарственное воздействие говорить об их генетической детерминированности.
Теперь остановимся на проблеме правомочности экстраполяции
данных, полученных при изучении лекарств на мышах, на человека.
После
полного
секвенирования
генома
мыши (Mouse Genome 
Sequencing Consortium, 2002) и последующих исследований (Rosenthal 
& Brown, 2007) выяснилось, что геномы мыши и человека по своей первичной структуре кодирующей части гомологичны на 99 %. На сколько
мала эта разница можно судить по результатам секвенирования 22 пар
аутосом человека по фамилии Вентер (Levy et al., 2007): диплоидный
секвеном даже у одного индивидуума различался на 0,5 %! Менее 300 
генов при сравнении геномов мыши и человека являются уникальными,
остальные гены являются ортологами или гомологами (Jorge-Nebert et 
al., 2007). Конечно, структура ДНК одинакова в каждой клетке, а принадлежность клетки к тому или иному типу ткани и клеточные функции
определяются мРНК, совокупность которых называется транскриптомом. В том же декабрьском номере Nature за 2002 год, в котором были
опубликованы результаты первичного секвенирования генома мыши,
были представлены результаты анализа мышиного транскриптома с
помощью функционального аннотирования более 60 тыс. полноразмерных кДНК (The FANTOM Consortium and the RIKEN Genome Exploration 
10