Экспериментальная фармакогенетика циклофосфамида: диссертация

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК 

 
ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ 
ФАРМАКОЛОГИИ РАН 
 
 
 
 
На правах рукописи 
 
УДК 615.454.2 
 
ТЕЛЕГИН 
Леонид Юрьевич 
 
 
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОГЕНЕТИКА 
ЦИКЛОФОСФАМИДА 
 
 
(14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология) 
 
 
 
 
 
Д и с с е р т а ц и я 
на соискание учёной степени 
доктора медицинских наук 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

Москва — 2010 

 
- 2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Памяти моих родителей, Прасковьи Ивановны Полянской  
и Юрия Владимировича Телегина, 
и рано ушедших Валентина Викторовича Рупасова, 
Кира Николаевича Гринберга, 
Владимира Георгиевича Черникова, 
Георгия Фёдоровича Жирнова, 
Бориса Константиновича Чернова, 
Николая Владимировича Корчагина, 
Марианны Викторовны Корчагиной, 
Татьяны Владимировны Анфаловой 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
- 3 
О Г Л А В Л Е Н И Е 

Стр. 

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………...6 
 
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 

1.1 Фармакогенетика и фармакогеномика……………………………...11 

1.2 Мыши как объект экспериментальных фармакогенетических 
исследований……………………………………………………………..15 

1.3 Циклофосфамид, структура, метаболизм, некоторые аспекты 
фармакокинетики и фармакодинамики……………………………..17 

1.4 Влияние циклофосфамида на иммуногенез. Чувствительность 
T- и B-лимфоцитов………………………………………………………29 

1.5 Мафосфамид, сарколизин, тиофосфамид, цитозинарабинозид и 
циклоспорин A…………………………………………………………….34 

1.6 Биомаркёры резистентности (чувствительности) к ЦФ: ортология человек-мышь и краткая характеристика…………………42 

1.7 Генетические различия у мышей в чувствительности к ЦФ.....47 

1.8 Предпосылки для обнаружения нового механизма действия 
ЦФ…………………………………………………………………………...50 
 
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 
 
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 

2.1 Животные…………………………………………………………………55 

2.2 
Антиген………………………………………………………………......55 

2.3 
Иммунодепрессанты…………………………………………………..56 

2.4 
Метод определения антителообразующих клеток (АОК) в селезёнке мышей…………………………………………………………..56 

2.5 
Методика активации циклофосфамида in vivo…………………...57 

2.6 
Методы исследования действия иммунодепрессантов in 
vitro………………………………………………………………………...57 

2.6.1 Действие на общую популяцию клеток селезёнки мышей…….57 

 
- 4 
2.6.2. Действие на T- и B-клетки…………………………………………...58 

2.6.3. Влияние на пролиферацию T-клеток селезёнки………………….60 

2.6.4 Оценка иммунодепрессивного действия препаратов на лимфоциты человека…………………………………………………….…….60 

2.7. Определение фенотипа HLA (HLA-A, HLA-B и HLA-C) ЛПК исследуемых доноров……………………………………………..............61 

2.8. Получение цитозолей из ЛПК человека………………….………...61 

2.9. Методы определения ферментной активности………………..61 

2.9.1. Получение S9-фракции клеток печени и селезёнки и микросом 
клеток печени мышей…………………………………………………62 

2.9.2. Определение относительного содержания группы изоформ 
цитохромов P-450В в печени мышей………………..……………...62 

2.9.3. Определение активности алкогольдегидрогеназы (ADH)….....62 

2.9.4. Определение активности альдегиддегидрогеназы (ALDH)…...62 

2.10. Определение содержание свободных сульфгидрильных 
групп………………………………………………………………………63 

2.11. Определение акролеина……………………………………………….63 

2.12. Методика определения уровня репликативного и репаративного синтеза ДНК в спленоцитах мышей…………………......…..63 

2.13. Метод оценки мутагенного действия циклофосфамида, мафосфамида и их комбинации…………………………………………63 

2.14. Статистическая обработка результатов опытов……………64 
 
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ 
 

3.1. Чувствительность мышей разных линий к иммунодепрессивному действию циклофосфамида, сарколизина и тиофосфамида in vivo………………………………………………………..…………65 

3.2. Чувствительность мышей BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию цитозинарабинозида и циклоспорина A in 
vivo…………………………………………………………………………68 

3.3. Чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к 

 
- 5 
алкилирующим агентам у мышей BALB/c и DBA/2………………70 

3.4. Чувствительность спленоцитов BALB/c и DBA/2 к иммунодепрессивному действию цитозинарабинозида………….…………71 

3.5. Влияние циклофосфамида на T- и B-клетки селезёнки мышей 
BALB/c и DBA/2………………………………………………………….73 

3.6. Чувствительность лимфоцитов периферической крови (ЛПК) 
человека к действию активированного in vivo циклофосфамида 
и тиофосфамида……………………………………………………….75 

3.7. Возможные причины различий в индивидуальной чувствительности лимфоцитов человека к действию алкилирующих агентов……………………………….………………………………………..82 

3.8. Особенности токсического действия циклофосфамида у мышей линий BALB/c и DBA/2………………………………………...….84 

3.9. Определение уровня репликативного и репаративного синтеза 
ДНК в спленоцитах интактных мышей BALB/c и DBA/2…..….102 

3.10. Новый механизм иммунодепрессивного и мутагенного действия циклофосфамида…………………………………………………103 
 
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ………...108 
 
Глава 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………...124 
 
ВЫВОДЫ…………...…………………………………………………………..126 
 
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………...………………...128 
 
 
 

 

 

 

 

 

 
- 6 
В В Е Д Е Н И Е 

 

 
Тема настоящего исследования тесно переплетается с одной из веду
щих задач Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии 

РАН – определение метаболического статуса человеческого организма (Л. А. 

Пирузян, 2004) для реализации принципа индивидуализации лекарственной 

терапии и, в частности, иммунодепрессивной терапии. Широкое использова
ние иммунодепрессантов ставит перед клиницистами задачу оценить инди
видуальную, наследственно обусловленную чувствительность (резистент
ность) к лекарственному воздействию. Очевидно, что для решения этой зада
чи, прежде всего, необходимы целенаправленные экспериментальные иссле
дования. 

Вопрос о значении наследственных факторов в определении степени 

иммунодепрессии, 
возникающей 
под 
влиянием 
химиопрепаратов
иммунодепрессантов, ранее систематически исследовался эксперименталь
ной группой лаборатории иммуногенетики Института медицинской генетики 

АМН СССР.  

Всё началось с экспериментального факта, обнаруженного Львом 

Алексеевичем Певницким в процессе работы над докторской диссертацией 

(Л. А. Певницкий, 1974) – наличие межлинейных различий у мышей в степе
ни лекарственно индуцируемой иммунологической толерантности. Это со
стояние специфической иммунологической ареактивности (неотвечаемости) 

возникает в результате сочетанного введения в организм экспериментального 

животного огромной дозы антигена (тем самым активируется весь иммуно
компетентный клон) и лекарственного препарата-иммунодепрессанта, при
водящего к элиминации активированного антигеном клона клеток иммунной 

системы (так называемая, клональная форма толерантности, см. Л. Н. Фонта
лин и Л. А. Певницкий, 1978). Данное состояние специфично – сохраняется 

полноценный иммунный ответ на другие антигены. Наилучшие результаты 

 
- 7 
были получены у мышей при использовании в качестве антигена эритроци
тов барана (ЭБ), в качестве иммунодепрессанта – циклофосфамида (ЦФ). 

Длительность состояния полученной таким образом иммунологической то
лерантности сохранялась до 1 года (почти половина мышиной жизни).  

Нами первоначально был изучен вопрос о существовании подобных 

межлинейных различий у мышей в степени подавления ЦФ первичной им
мунной реакции на оптимальную иммуногенную дозу ЭБ. В широком диапа
зоне доз иммунодепрессанта мы выявили линии мышей, контрастно реаги
рующих на иммунодепрессивное воздействие: BALB/cJLacSto (резистентная 

линия) и DBA/2JSto (чувствительная линия) (Л. А. Певницкий, Л. Ю. Теле
гин, В. Н. Большев, 1977). 

При анализе причин обнаруженных различий мы установили, что им
мунологические механизмы здесь играют подчинённую роль: сопоставление 

нормальной реакции мышей разных генотипов на антиген и степени относи
тельной иммунодепрессии показало, что между этими параметрами связи 

нет. Так, например, при использовании ЭБ в дозе 5×108 клеток высота им
мунного ответа в контроле была практически одинаковой у мышей иссле
дуемых линий, тогда как показатели относительной иммунодепрессии суще
ственно различались. Следует также отметить, что гены комплекса H-2, по
видимому, не определяют чувствительность (резистентность) к препарату, 

поскольку мыши контрастных генотипов BALB/c и DBA/2 имеют одинако
вый 
H-2-гаплотип 
– 
H-2d 
(http://jaxmice.jax.org/strain/000651.html 
и 

http://jaxmice.jax.org/strain/000671.html). Причину межлинейных различий 

при иммунодепрессии и иммунологической толерантности следовало искать 

в особенностях поведения лекарственного препарата-иммунодепрессанта в 

организме мышей разных генотипов.  

Мы исследовали (Л. Ю. Телегин, 1981) следующие маркёрные призна
ки фармакокинетики и фармакодинамики ЦФ в организме мышей разных ли
ний: особенности метаболизма ЦФ в микросомах клеток печени; фармакоки
нетику содержания в сыворотке крови активных алкилирующих метаболитов 

 
- 8 
ЦФ; иммунодепрессивное действие на тест-клетки ЦФ, активированного in 

vitro ("активный" постмикросомальный супернатант) и in vivo ("активная сы
воротка"); чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к имму
нодепрессивному влиянию "активной сыворотки". 

В результате проведённых исследований было установлено, что для 

мышей "резистентного" генотипа BALB/c по сравнению с мышами "чувстви
тельной" линии DBA/2 была характерна более высокая скорость метаболизма 

ЦФ в печени, большее содержание активных алкилирующих метаболитов в 

крови, но меньшая чувствительность иммунокомпетентных клеток-мишеней 

селезёнки. В процессе проведения опытов был обнаружен ранее неизвестный 

факт отсутствия параллелизма между содержанием активных алкилирующих 

продуктов метаболизма ЦФ в образцах "активной сыворотки" и её иммуно
депрессивным действием в отношении тест-клеток. Тогда была высказана 

гипотеза, объясняющая это явление, – усиление интактным ЦФ действия 

своих активных метаболитов – и она нуждалась в экспериментальной про
верке. 

Цель и задачи исследований. Настоящее диссертационное исследова
ние является логическим продолжением ранее проведённых нами работ. 

Дальнейшее выяснение механизмов действия и особенностей поведения в ор
ганизме циклофосфамида, объясняющих генетические различия в реакции на 

этот лекарственный препарат, явилось целью настоящей работы. Для дости
жения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 

1. Выяснить, сохранятся ли подобные соотношения между мышами ли
ний BALB/c и DBA/2 при использовании в качестве иммунодепрессантов ле
карственных препаратов иной структуры и механизма действия (сарколизин, 

тиофосфамид, цитозинарабинозид, циклоспорин A). 

2. Исследовать сравнительную чувствительность иммунокомпетентных 

клеток-мишеней (T- и B-клеток селезёнки) мышей линий BALB/c и DBA/2 к 

иммунодепрессивному действию ЦФ in vitro. 

 
- 9 
3. Изучить чувствительность лимфоцитов периферической крови чело
века к действию ЦФ и тиофосфамида, определить степень изменчивости это
го признака, выделить разные типы реакции на химиопрепараты (высоко- и 

низкореагирующие индивидуумы) и исследовать возможные механизмы раз
личий в чувствительности к иммунодепрессантам. 

4. Изучить особенности острого токсического действия ЦФ у мышей 

BALB/c и DBA/2, обладающих контрастной чувствительностью к иммуноде
прессивному действию ЦФ (активность некоторых ферментов метаболизма 

ЦФ, кинетика токсического метаболита ЦФ, акролеина, кинетические пока
затели содержания свободных сульфгидрильных групп). 

5. Определить уровень репликативного и репаративного синтеза ДНК в 

спленоцитах интактных мышей BALB/c и DBA/2 как возможного фактора, 

определяющего разную чувствительность клеток-мишеней мышей данных 

генотипов к действию ЦФ. 

6. В разных экспериментальных условиях подробно исследовать ранее 

не установленный механизм биологического действия ЦФ, проверив выдви
нутую ранее нами гипотезу (Л. Ю. Телегин, 1981) об усилении нативным ЦФ 

действия собственных активных метаболитов. 

Научная новизна работы. Использование фармакогенетического под
хода позволило впервые выявить генетически контролируемые факторы, их 

роль и значение в определении степени чувствительности (устойчивости) к 

действию циклофосфамида. Впервые было показано, что высокая степень 

чувствительности к действию циклофосфамида определяется сочетанием 

низкой активности систем активации и инактивации препарата в процессе 

метаболизма, что обеспечивает феномен усиления циклофосфамидом биоло
гического действия собственных активных метаболитов; низкого содержания 

свободных сульфгидрильных групп в клетках-мишенях и низкой активно
стью в них систем репарации повреждений ДНК. Фенотип устойчивости к 

действию циклофосфамида in vivo определяется максимальным значением 

этих показателей. Впервые обнаружено явление усиления циклофосфамидом 

 
- 10 
действия своих собственных активных метаболитов, и существование этого 

феномена была доказано при исследовании иммунодепрессивного, антипро
лиферативного и мутагенного действия циклофосфамида. 

Практическая ценность работы. Проведённые исследования вносят 

вклад в понимание механизмов действия циклофосфамида, открывая новые 

возможности при разработке наиболее эффективных способов подавления 

пролиферативной реакции клеток при их экстракорпоральной обработке (по
лучен патент РФ № 2393481, зарегистрировано в Государственном реестре 

изобретений Российской Федерации 27 июня 2010 г.). Полученные сведения 

о конкретизации механизмов, с помощью которых реализуются генетические 

различия в действии иммунодепрессивных и противораковых препаратов, 

могут быть применены при разработке подходов к персонифицированной 

медицине, главный принцип которой – "лечить не болезнь, а больного" – был 

сформулирован знаменитым русским терапевтом Михаилом Яковлевичем 

Мудровым ещё в 1820 г. в книге "Слово о способе учить и учиться медицине 

практической": "Я намерен сообщить вам новую истину, которой многие не 

поверят и которую, может быть, не все из вас постигнут. Врачевание не со
стоит в лечении болезни... Врачевание состоит в лечении самого больного.… 

Каждый больной, по различию сложения своего, требует особого лечения, 

хотя болезнь одна и та же" (цит. по А. Л. Мясников, 1951).