Квалиметрия в гистохимии ферментов (на примере кожных желез млекопитающих)

Инфра-Инженерия
Мосва
2013

РОССИЙСКАЯАКАДЕМИЯНАУК
Инститтпроблемэолоиииэволюции
им.А.Н.Северцова

А.Б.Киладзе,Н.К.Джемхадзе

КВАЛИМЕТРИЯ
ВГИСТОХИМИИ
ФЕРМЕНТОВ

напримереожныхжелезмлеопитающих

А.Б.Киладзе,Н.К.Джемхадзе.Квалиметриявистохимииферментов
УДК611.018.72+611.773+611.774
ББК28.6+30.607я73
К39

Ответственныйредатор:
О.Ф.Чернова–д-рбиол.на,зав.лаб.морфолоичесихадаптаций
позвоночныхИнститтапроблемэолоиииэволюцииим.А.Н.СеверцоваРАН.

Рецензенты:
Г.Г.Азальдов–д-рэон.на,профессор,лавныйначныйсотрдниЦентральнооэономио-математичесооинститтаРАН;
В.В.Делеторсая–д-рмед.на,зав.лаб.истохимиииэлетронной
миросопииРоссийсооонолоичесооначнооцентраим.Н.Н.
БлохинаРАМН;
А.В.Сров–д-рбиол.на,зав.лаб.сравнительнойэтолоиии
биооммниаций,зам.диреторапоначнойработеИнститтапроблем
эолоиииэволюцииим.А.Н.СеверцоваРАН.

КиладзеА.Б.,ДжемхадзеН.К.
К39
Квалиметриявистохимииферментов(напримере
ожныхжелезмлеопитающих).–М.:Инфра-Инженерия,
2013.–128с.
Илл.26.Табл.25.Библ.114.

ISBN978-5-9729-0068-8

Монорафиясодержитвведениеметодоввалиметричесооанализавистоэнзиматичесиеисследованияожных
железмлеопитающих.Расрытасщностьбиовалиметрии
анаи.Обсждаетсязначениевалиметриивистохимии
ферментов.Приведенабиометричесаяобработацифровых
аналоовистоэнзиматичесойативностиожныхжелезмлеопитающихсиспользованиемметодовдесриптивнойстатистии,орреляционно-ререссионнооидисперсионнооанализов,атажерядовдинамии.Приведеныонретныепримерыиспользованияметодовбиовалиметрииибиометрии
приоценеистоэнзиматичесойативностиожныхжелезна
примерерызновинасеомоядных.

РаботавыполненаприфинансовойподдержерантаПрезидентаРФ
дляведщихначныхшол(проетНШ-5928.2012.4).

©КиладзеА.Б.,ДжемхадзеН.К.,авторы,2013
©Издательство«Инфра-Инженерия»,2013

ISBN978-5-9729-0068-8

Предисловие

Еслипосмотретьнаразвитиенаи(вовсеммноообразии
ееотраслей)вретроспетиве,толеозаметить,чтоэтобыл
неравномерныйдляотдельныхееподразделенийпроцесс.В
аие-топериодынапервыеместавыдвиалисьодниначныедисциплины,вдриеэпохи-иные.Оставляявстороне
анализпричинэтоо,несомненно,объетивносществющеоявления,сажемтольо,чтозапоследниедесятилетияроль
"передовой"(всмыслевлияниянаразвитиенаивцеломи
нажизньчеловечества-вообще)естественно-начнойдисциплиныпостепенновсебольшепереходитсферебиолоиивовсемиантсомразнообразииисследемыхеюобъетовиихвзаимосвязей.
Невпоследнююочередьэтотпроцессявляетсяблестящей
иллюстрациейи,одновременно,имманентноприсщейчеловечеств,абиолоичесомвид,высазаннойГалилеем
масиме:"Нжноизмерятьвсеизмеримоеиделатьизмеримымто,чтопоаещенеподдаетсяизмерению".Частнымслчаемреализацииениальной(непобоимсяэтоослова)мыслиГалилеоГалилеяявляетсянебольшая,новесьмаемая
монорафиядвхченых-А.Б.КиладзеиН.К.ДжемхадзеизизвестноодалеозапределаминашейстраныИнститта
проблемэолоиииэволюцииим.А.Н.СеверцоваРАН.
Длястатистичесойобработиполченноообширнооэспериментальнооматериалаониспешноиспользовалиаппаратмноихметодовматематичесойстатистии-орреляционноо,ререссионнооидисперсионнооанализа.
Болеетоо,онинепростовантифицировалипроцесси
полченныерезльтатычистобиолоичесихисследований,
ноисделалиследющийоченьважныйша-поазали,что
примененнаяимиметодолоияпозволяетрешатьзадачпринципиальнойважности:ввестипараметр"ачество"(досихпор
райнередоиспольземыйвбиометричесихрасчетах)аравноправныйобъетбиолоичесихисследований.Тоесть
поазали,чтосозрелинеобходимыеидостаточныесловия

А.Б.Киладзе,Н.К.Джемхадзе.Квалиметриявистохимииферментов

дляправомерноовозниновенияещеоднойотрасливалиметрии-биовалиметрии.Темсамымнапримеребиолоии
подтвердилиправомерностьмысли,залюченнойвблестящемафоризмеизвестнооотечественнооматематиаД.Б.
Юдина:"Качество-этоещенепознанноеоличество".

ПрофессорГ.Г.Азальдов

Важдойестественнойнаезалюченостольоистины,
сольовнейестьматематии.
ИмманилКант(1724-1804)

Введение

Современнаябиолоияотличаетсяшироимровнемвзаимопрониновениявсмежныеначныеотрасли,чтовыражаетсявформированиишироойсетимежпредметныхсвязей,
обеспечивающихпостпательноеразвитиемноихперспетивныхнаправленийестествознанияв"точахроста",формирющихвысоийровеньдостинтыхрезльтатов.Полааем,
чтотааяоранизациясовременнооначноознанияобеспечитрешениесамыхсложныхзадач,стоящихпередатальныминаправлениямибиолоииизоолоии,обеспечиваядоазательнюосновполченныхрезльтатов,отличающихся,
ромепрочео,сщественныминновационнымпотенциалом.
Предлааемаячитателюниапосвященавопросамистохимичесойвалиметрии,подоторойпонимаютооперацию
двхначныхнаправлений-истохимииферментов,являющейсяморфофизиолоичесойдисциплиной,ибиовалиметрии-разделавалиметрии,изчающеопроблемоличественноовыраженияачественныхсостоянийбиосистемы.Вэтой
связиистохимичесаявалиметриярассматриваетвопросы
оличественноовыраженияистоэнзиматичесойативности
натанево-леточномровне,приэтомосновыновооначноонаправлениярасрываютсянаминапримереистоэнзиматичесойативностифосфатазожныхжелезмлеопитающих.Традиционнознаоваяилибвенно-цифроваяформа
выраженияативностиферментов,использемаявморфолоичесойэнзимолоиинасветовомилильтрастртрномровнях,лишьчастичнорешалапроблемоцениистохимичесой
ативности,придаваярезльтатамлишьописательно-радационныйхаратер,чтосщественнымобразомораничиваловозможностиисследователяпоинтерпретациидостинтыхрезльтатов,оторыебылотрдновнедритьвпратизоолоиидля
решениябиолоичесихзадач.Приэтомполноценномвнедрениюистохимичесихрезльтатоввповседневнюзоолоичесюработмешалавомноомнесовершеннаясистема
представленияистоэнзиматичесойативности,непредсмат

А.Б.Киладзе,Н.К.Джемхадзе.Квалиметриявистохимииферментов

ривающаяиспользованияцифровыханалоовввидебалльныхоцено.Квалиметрияанаапозволяетоперироватьэспертнымиоценамиистоэнзиматичесойативности,оторю
исследовательреистриретвизально,использямиросопичесютехни.Вэтомзалючаетсяотличиевалиметриине
тольоотморфометрии,предсматривающейопределение
линейно-площадныххаратеристиистолоичесихилицитолоичесихстртр,ноихимичесооанализа,предполаающеооличественноесодержаниетооилииноофермента,а
тажеденситометрии,врамахоторойвыявляетсяоптичесаяплотностьпочернения.Следетотметить,чтонабазелассичесихподходовцитофотометриииоличественнойистохимии(Бродсий,1966;Аросин,Папаян,1977;Введениев
оличественнюистохимиюферментов,1978)впоследнее
времяисследователиативноосваиваютразличныеаппаратно-прораммныеомплесы(Ирьяновидр.,2004),внедряют
радировочныестандарты(Силантьева,Горбач,2009),атаже
рафичесиеиматематичесиеомпьютерныепрораммы
(AdobePhotoshopиMathcad),позволяющиеспомощью"писельноометода"автоматизироватьизмеренияинтенсивности
истохимичесихреаций(Старцева,Черто,2012;Чертоидр.,
2012).Приведенныеметодии,несомненно,обладающиепризнаамиобъетивности,требютналичиядороостоящейитрднодостпнойаппаратры,чтонесольоораничиваетихповсеместноевнедрение.Вэтойсвязиобнарживаетсясщественнаяэономичесаяэффетивностьотиспользованияименно
валиметричесооанализа,сводящеосяабстратнойвантифиации[отлат.quantum–сольо+facere–делать]истохимичесойативности,посравнениюсболеедороостоящимивышеназваннымиметодами.
Напротяжениипоследнихлетвработахотечественных
ченыхпланомернодоазываетсянеобходимостьчетаистоэнзиматичесойативностифосфатазожныхжелезвхемооммниацииприформированииинформационноополя
особейавмежполовойсистеме,таинамежвидовомровне,всистематиевачестведополнительнооритериявида,
атажеабазовоофоновоопараметра,определяющео
марировочноеповедениеирепродтивно-сесальныеаты
млеопитающих.Крометоо,выявленыважнейшиеорреляциимеждистоэнзиматичесойативностьюожныхжелез,
имеющихразличнютопорафию,поазаныособенностипо

ловой,возрастной,сезоннойиеорафичесойизменчивостиистоэнзиматичесойативностинапримережелезожноопоровамлеопитающих.
Говоряосщностиистохимииферментов,необходимоазатьнаееописательнюоснов,врамахоторойпроводится
исследованиехимичесоосоставатанейилетоприсохраненииихморфостртры,атажестановлениеистоицитолоичесойлоализациианализиремыхэнзимов(Лппа,1980).Вэтойсвязипереднамистоялазадача,связаннаяс
внедрениемметодовбиовалиметриивистохимиюферментов,чтоподразмеваетиспользованиецифровыханалоовдля
выраженияистоэнзиматичесойативностиспоследющей
полноценнойстатистичесойобработойданных,подразмевающейиспользованиедесриптивноо,орреляционно-ререссионноо,дисперсионноо,ластернооидрихформ
анализа.Всеэтопозволяетвыстроитьстандартизированный
алоритмистохимичесихисследований,достинтьтаоо
представлениярезльтата,оторыйбыбазировалсянапринципахдоазательности,атажеобосноватьонретныезадачи,стоящиеапередчастнымипроблемамизоолоии,таи
"свозными"вопросамиобщейбиолоии.
Стртраработытаова,чтопервыелавыпосвящены
вопросамистоэнзиматичесойвалиметрииасвоеобразноометодичесооаппарата,затемприведеналава,посвященнаябиометрии,дерасрываетсясщностьдесриптивнойстатистии,орреляционно-ререссионнооидисперсионнооанализов,атажерядовдинамии.Залючительная
лавасодержитпратичесоеиспользованиеметодовбиовалиметрииибиометриинапримереистоэнзиматичесойативностиожныхжелезмлеопитающихспоследющимбиолоичесимобсждениемполченныхрезльтатов.
Проведеноистохимичесоеисследованиежелезожноо
поровамлеопитающихMammalia,относящихсянеоторым
видамотрядарызновRodentia,атажеобыновеннооежа
Erinaceuseuropaeus,относящеосяотряднасеомоядных
Insectivora(табл.1).

Введение

А.Б.Киладзе,Н.К.Джемхадзе.Квалиметриявистохимииферментов

Таблица1
Переченьизченнооматериала

Вид 
Пол, возраст, 
сезон 
Место добычи 
Количество 
изученных 
особей 

Пробы кожи 

Копетдагская полевка - Microtus socialis paradoxus 
Ognev et Heptner, 
1928 
 

Самец, самка, 
adultus, 
лето, зима  

Юго-Западная 
Туркмения 
(хр. Копетдаг) 
 

5 самцов и 5 
самок в разное время года, всего 20 
особей 

Загривок, верхние веки, углы 
рта, анальная область, оволошенная часть подошв 
задних лап 

Китайская полевка 
- Lasiopodomys 
mandarinus MilneEdwards, 1871 
 
 
 
 
 

Самец, 
самка, 
juv.–ad.: 20, 
40, 120, 180, 
365 дн., 
охвачены все 
сезоны 

Лабораторная 
колония, происходящая от 
особейоснователей 
из степнолуговых биоценозов Южной Бурятии 

3 самца и 3 
самки из каждой возрастной группы, 
всего 30 особей 
 
 
 

То же  
 
 
 
 
 
 

Полевка Брандта - 
Lasiopodomys 
brandtii Radde, 1861 
 

Самец, 
самка, 
adultus 

Особи из лабораторной 
колонии - первые потомки 
животных из 
Монголии 
(Хангай) 

5 самцов и 5 
самок, всего 
10 особей 

То же  
 

Восточноевропейская полевка - Microtus rossiaemeridionalis Ognev, 1924 

Самец, 
самка, 
adultus 

Особи из окр. 
г. Абакан 
(Красноярский 
край) 

8 самцов и 6 
самок, всего 
14 особей 

То же 
  

Хромосомные расы 
обыкновенная полевки - Microtus arvalis Pallas, 1779: 
M. arvalis arvalis 
M. arvalis obscurus 

Самец, 
самка, 
adultus 

Особи формы 
«arvalis» из 
окр. д. Чашниково (Московская обл.). 
Особи формы 
«obscurus» из 
окр. г. Ереван 
(Армения) 

6 самцов и 6 
самок формы 
«arvalis», 
всего 12 особей. 
4 самца и 4 
самки формы 
«obscurus», 
всего 8 особей 

То же  

Хомячок Кэмпбелла - Phodopus 
campbelli Thomas, 
1905 
 
 
 
 

Самец, 
самка, 
3 и 6 мес., 
весна, осень 

Лабораторная 
популяция от 
особейоснователей 
из северовосточной 
части Монголии 

35 самцов 
и  20 самок, 
всего 55 особей 

Загривок, среднебрюшная железа 

Оончаниетабл.1

Вид 
Пол, возраст, 
сезон 
Место добычи 
Количество 
изученных 
особей 

Пробы кожи 

Джунгарский хомячок - Phodopus sungorus Pallas, 1773 

Самец, 
самка, adultus, весна, 
осень 

То же  
15 самцов и 
10 самок, 
всего 25 особей 

Загривок 

Обыкновенный ёж - 
Erinaceus europaeus 
Linnaeus, 1758 
 

Самец,  
adultus, 
осень, весна 

Московская 
область 
6 самцов 
Загривок, веки, 
углы рта, анальная область, оволошенная часть 
подошв задних 
лап 

Гистохимичесимиметодамиизчалисальныеипотовые
железыожноопорова.Пробыожифисировалив10%номнейтральномформалиненахолодевтечение24ч.Толщиназамороженных"плавающих"срезовсоставила15мм.
ГистохимичесиереациипроводилипометодиамГомо-ри
(Берстон,1965;Бданцев,2008)всобственныхмодифиациях.б.н.Н.К.Джемхадзеспециальнодляожныхжелез:на
ислю(КФ)ищелочню(ЩФ)фосфатазыиаденозинтрифосфатаз(АТФаз),присоблюдениисловийонтроля-идентичнойпараллельнойобработиматериалаионтрольных
реацийбезсбстрата.Специальнодляизченияожноопороваотработанаэспозицияинбации(t=37°C)дляаждой
истоэнзиматичесойреации:наКФсиспользованиемацетатнообфера(pH5,0)-2,0ч;наЩФсиспользованиемтрисбфера(pH9,2)-1,5ч;наАТФазсиспользованиемтрисбфера(pH7,2)-2,0ч.Дляпровериморфолоичесойидентичностистртрпрепаратыорашивалиематосилиномпо
Карацци(Миросопичесаятехниа,1996).Изчениепрепаратовпроводилиспомощьюмиросопамари"CarlZeiss"
(Германия,фирма-изотовитель"VEBCarlZeissJena").Резльтат
фисировалинаосновепросмотрааждоосреза,последовательносмещаяполезрениямиросопа,изчаяпо5–10железизоднойпробыотаждойособи.
Дляадеватнойоцениистохимичесойативностиферментовследетчитыватьритерииисто-ицитохимичесих
способовихвыявления,базирющихсянаобъетивныхособенностях.Та,КФвыявляетсяввидемелойтемнойзернистостивлетахвсехтипов,приэтомееварьирющееоли
Введение

А.Б.Киладзе,Н.К.Джемхадзе.Квалиметриявистохимииферментов

чествообнарживаетсявзрелыхсереторныхлетахооло
протоовжелезы.СпецифичесийпродтреациинаЩФ
представляетсобойдиффзнораспределеннюмассоричнево-серыхоттенов,отораяввысоихонцентрацияхсодержитсявмалодифференцированныхисозревающихлетах;ферментхорошомариретэндотелийровеносныхапилляров.ФерментАТФазаидентифициретсяпорасно-оричневомосадразныхоттенов,приэтомонплотнеев
малодифференцированныхлетах,чемвзрелых.Подобная
артинасвязанассобственносереторнымпроцессом,авнтрилеточноерасположениеосадов–сцитолоичесойицитохимичесойпривязанностьюизченныхферментоввнтрилеточныморанеллам,приэтомверифиацияпостанови
реацииобеспечиваетсяследющимиположениями:
1)КФ,ЩФ,АТФазаидентифицированыпосвоимсвойствам
сбиохимичесимипоазателями,описаннымиранеевбиосистемах;
2)притщательномпроведенииистоэнзиматичесихреацийлассичесимиметодамиложнаялоализацияиартефатыислючаются;
3)изченныефосфатазыимеютсвоичетиепривязанностивнтрилеточныморанеллам(лизосомам,митохондриям,леточныммембранам),чтообеспечиваетистинностьтратовилоализациипреципитата.
Сравнительно-истохимичесийанализрезльтатовачественныхистоэнзиматичесихреацийоснованнапринципе
етероенностисодержанияразличныхферментоввожных
железахвзависимостиотвида,пола,возрастаживотноо,а
тажеотсезона.Насинтересовалосостояниезрелыхлето,
оторые,вонечномсчете,иопределяютхаратервыделяемоосерета.
Дляреализациивалиметричесоометоданеобходимым
словиемявляетсясозданиеадеватнойшалыферментной
ативности,поэтоммыпровелиранжированиеативности
ферментовожныхжелезсцифровымпредставлениемрезльтатов.Разработаннаяшала,приведеннаявтабл.3(см.
раздел1.2.),былапринятазаосноввнашихдальнейшихисследованиях.Таимобразом,ативностьферментовприведенавдвхформатах,аименно:
1)стандартноеобозначениеативности(СОА)ввидезнаов;