Квалиметрия в гистохимии ферментов (на примере кожных желез млекопитающих)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова




А.Б. Киладзе, Н.К. Джемухадзе





КВАЛИМЕТРИЯ В ГИСТОХИМИИ ФЕРМЕНТОВ
на примере кожных желез млекопитающих












Инфра-Инженерия Москва
2013

УДК 611.018.72 + 611.773 + 611.774
ББК 28.6 + 30.607я73
      К39

Ответственный редактор:
   О.Ф. Чернова - д-р биол. наук, зав. лаб. морфологических адаптаций позвоночных Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН.

Рецензенты:
   Г.Г. Азгальдов - д-р экон. наук, профессор, главный научный сотрудник Центрального экономико-математического института РАН;
   В.В. Делекторская - д-р мед. наук, зав. лаб. гистохимии и электронной микроскопии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН;
   А.В. Суров - д-р биол. наук, зав. лаб. сравнительной этологии и биокоммуникаций, зам. директора по научной работе Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН.

      Киладзе А.Б., Джемухадзе Н.К.
К 39 Квалиметрия в гистохимии ферментов (на примере кожных желез млекопитающих). - М.: Инфра-Инженерия, 2013. - 128 с.
      Илл. 26. Табл. 25. Библ. 114.

ISBN 978-5-9729-0068-8

   Монография содержит введение методов квалиметричес-кого анализа в гистоэнзиматические исследования кожных желез млекопитающих. Раскрыта сущность биоквалиметрии как науки. Обсуждается значение квалиметрии в гистохимии ферментов. Приведена биометрическая обработка цифровых аналогов гистоэнзиматической активности кожных желез млекопитающих с использованием методов дескриптивной статистики, корреляционно-регрессионного и дисперсионного анализов, а также рядов динамики. Приведены конкретные примеры использования методов биоквалиметрии и биометрии при оценке гистоэнзиматической активности кожных желез на примере грызунов и насекомоядных.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ для ведущих научных школ (проект НШ-5928.2012.4).

               © Киладзе А.Б., Джемухадзе Н.К., авторы, 2013 © Издательство «Инфра-Инженерия», 2013


ISBN 978-5-9729-0068-8

       Предисловие


   Если посмотреть на развитие науки (во всем многообразии ее отраслей) в ретроспективе, то легко заметить, что это был неравномерный для отдельных ее подразделений процесс. В какие-то периоды на первые места выдвигались одни научные дисциплины, в другие эпохи - иные. Оставляя в стороне анализ причин этого, несомненно, объективно существующего явления, скажем только, что за последние десятилетия роль "передовой" (в смысле влияния на развитие науки в целом и на жизнь человечества - вообще) естественно-научной дисциплины постепенно все больше переходит к сфере биологии во всем гигантском разнообразии исследуемых ею объектов и их взаимосвязей.
   Не в последнюю очередь этот процесс является блестящей иллюстрацией и, одновременно, имманентно присущей человечеству, как биологическому виду, к высказанной Галилеем максиме: "Нужно измерять все измеримое и делать измеримым то, что пока еще не поддается измерению". Частным случаем реализации гениальной (не побоимся этого слова) мысли Галилео Галилея является небольшая, но весьма емкая монография двух ученых - А.Б. Киладзе и Н.К. Джемухадзе -из известного далеко за пределами нашей страны Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН.
   Для статистической обработки полученного обширного экспериментального материала они успешно использовали аппарат многих методов математической статистики - корреляционного, регрессионного и дисперсионного анализа.
   Более того, они не просто квантифицировали процесс и полученные результаты чисто биологических исследований, но и сделали следующий очень важный шаг - показали, что примененная ими методология позволяет решать задачу принципиальной важности: ввести параметр "качество" (до сих пор крайне редко используемый в биометрических расчетах) как равноправный объект биологических исследований. То есть показали, что созрели необходимые и достаточные условия


3

А.Б. Киладзе, Н.К. Джемухадзе. Квалиметрия в гистохимии ферментов

для правомерного возникновения еще одной отрасли квали-метрии - биоквалиметрии. Тем самым на примере биологии подтвердили правомерность мысли, заключенной в блестящем афоризме известного отечественного математика Д.Б. Юдина: "Качество - это еще не познанное количество".

Профессор Г.Г. Азгальдов

      В каждой естественной науке заключено столько истины, сколько в ней есть математики.
Иммануил Кант(1724-1804)

           Введение

   Современная биология отличается широким уровнем взаимопроникновения в смежные научные отрасли, что выражается в формировании широкой сети межпредметных связей, обеспечивающих поступательное развитие многих перспективных направлений естествознания в "точках роста", формирующих высокий уровень достигнутых результатов. Полагаем, что такая организация современного научного знания обеспечит решение самых сложных задач, стоящих перед актуальными направлениями биологии и зоологии, обеспечивая доказательную основу полученных результатов, отличающихся, кроме прочего, существенным инновационным потенциалом.
   Предлагаемая читателю книга посвящена вопросам гистохимической квалиметрии, под которой понимают кооперацию двух научных направлений - гистохимии ферментов, являющейся морфофизиологической дисциплиной, и биоквалимет-рии - раздела квалиметрии, изучающего проблему количественного выражения качественных состояний биосистемы. В этой связи гистохимическая квалиметрия рассматривает вопросы количественного выражения гистоэнзиматической активности на тканево-клеточном уровне, при этом основы нового научного направления раскрываются нами на примере гистоэнзиматической активности фосфатаз кожных желез млекопитающих. Традиционно знаковая или буквенно-цифровая форма выражения активности ферментов, используемая в морфологической энзимологии на световом или ультраструктурном уровнях, лишь частично решала проблему оценки гистохимической активности, придавая результатам лишь описательно-градационный характер, что существенным образом ограничивало возможности исследователя по интерпретации достигнутых результатов, которые было трудно внедрить в практику зоологии для решения биологических задач. При этом полноценному внедрению гистохимических результатов в повседневную зоологическую работу мешала во многом несовершенная система представления гистоэнзиматической активности, не предусмат

5

А.Б. Киладзе, Н.К. Джемухадзе. Квалиметрия в гистохимии ферментов

ривающая использования цифровых аналогов в виде балльных оценок. Квалиметрия как наука позволяет оперировать экспертными оценками гистоэнзиматической активности, которую исследователь регистрирует визуально, используя микроскопическую технику. В этом заключается отличие квалиметрии не только от морфометрии, предусматривающей определение линейно-площадных характеристик гистологических или цитологических структур, но и химического анализа, предполагающего количественное содержание того или иного фермента, а также денситометрии, в рамках которой выявляется оптическая плотность почернения. Следует отметить, что на базе классических подходов цитофотометрии и количественной гистохимии (Бродский, 1966; Агроскин, Папаян, 1977; Введение в количественную гистохимию ферментов, 1978) в последнее время исследователи активно осваивают различные аппаратно-программные комплексы (Ирьянов и др., 2004), внедряют градуировочные стандарты (Силантьева, Горбач, 2009), а также графические и математические компьютерные программы (Adobe Photoshop и Mathcad), позволяющие с помощью "пиксельного метода" автоматизировать измерения интенсивности гистохимических реакций (Старцева, Черток, 2012; Черток и др., 2012). Приведенные методики, несомненно, обладающие признаками объективности, требуют наличия дорогостоящей и труднодоступной аппаратуры, что несколько ограничивает их повсеместное внедрение. В этой связи обнаруживается существенная экономическая эффективность от использования именно квалиметрического анализа, сводящегося к абстрактной квантификации [от лат. quantum - сколько + facere - делать] гистохимической активности, по сравнению с более дорогостоящими вышеназванными методами.
   На протяжении последних лет в работах отечественных ученых планомерно доказывается необходимость учета гистоэнзиматической активности фосфатаз кожных желез в хемокоммуникации при формировании информационного поля особей как в межполовой системе, так и на межвидовом уровне, в систематике в качестве дополнительного критерия вида, а также как базового фонового параметра, определяющего маркировочное поведение и репродуктивно-сексуальные акты млекопитающих. Кроме того, выявлены важнейшие корреляции между гистоэнзиматической активностью кожных желез, имеющих различную топографию, показаны особенности по

6

Введение

ловой, возрастной, сезонной и географической изменчивости гистоэнзиматической активности на примере желез кожного покрова млекопитающих.
   Говоря о сущности гистохимии ферментов, необходимо указать на ее описательную основу, в рамках которой проводится исследование химического состава тканей и клеток при сохранении их морфоструктуры, а также установление гисто-и цитологической локализации анализируемых энзимов (Луп-па, 1980). В этой связи перед нами стояла задача, связанная с внедрением методов биоквалиметрии в гистохимию ферментов, что подразумевает использование цифровых аналогов для выражения гистоэнзиматической активности с последующей полноценной статистической обработкой данных, подразумевающей использование дескриптивного, корреляционно-регрессионного, дисперсионного, кластерного и других форм анализа. Все это позволяет выстроить стандартизированный алгоритм гистохимических исследований, достигнуть такого представления результата, который бы базировался на принципах доказательности, а также обосновать конкретные задачи, стоящие как перед частными проблемами зоологии, так и "сквозными" вопросами общей биологии.
   Структура работы такова, что первые главы посвящены вопросам гистоэнзиматической квалиметрии как своеобразного методического аппарата, затем приведена глава, посвященная биометрии, где раскрывается сущность дескриптивной статистики, корреляционно-регрессионного и дисперсионного анализов, а также рядов динамики. Заключительная глава содержит практическое использование методов биоквалиметрии и биометрии на примере гистоэнзиматической активности кожных желез млекопитающих с последующим биологическим обсуждением полученных результатов.
   Проведено гистохимическое исследование желез кожного покрова млекопитающих Mammalia, относящихся к некоторым видам отряда грызунов Rodentia, а также обыкновенного ежа Erinaceus europaeus, относящегося к отряду насекомоядных Insectivora (табл. 1).

7

А.Б. Киладзе, Н.К. Джемухадзе. Квалиметрия в гистохимии ферментов

Таблица 1

Перечень изученного материала

Вид                   Пол, возраст,  Место добычи    Количество   Пробы кожи       
                          сезон                       изученных                    
                                                       особей                      
Копетдагская по-     Самец, сам-     Юго-Западная   5 самцов и 5  Загривок, верх-  
левка - Microtus so- ка,             Туркмения      самок в раз-  ние веки, углы   
cialis paradoxus     adultus,        (хр. Копетдаг) ное время го- рта, анальная обOgnev et Heptner,    лето, зима                     да, всего 20  ласть, оволошен- 
1928                                                особей        ная часть подошв 
                                                                  задних лап       
Китайская полевка    Самец,          Лабораторная   3 самца и 3   То же            
- Lasiopodomys       самка,          колония, про-  самки из ка-                   
mandarinus Milne-    juv. - ad.: 20, исходящая от   ждой возрас-                   
Edwards, 1871        40, 120, 180,   особей-        тной группы,                   
                     365 дн.,        основателей    всего 30 осо-                  
                     охвачены все    из степно-     бей                            
                     сезоны          луговых био-                                  
                                     ценозов Юж-                                   
                                     ной Бурятии                                   
Полевка Брандта -    Самец,          Особи из ла-   5 самцов и 5  То же            
Lasiopodomys         самка,          бораторной     самок, всего                   
brandtii Radde, 1861 adultus         колонии - пер- 10 особей                      
                                     вые потомки                                   
                                     животных из                                   
                                     Монголии                                      
                                     (Хангай)                                      
Восточноевропей-     Самец,          Особи из окр.  8 самцов и 6  То же            
ская полевка - Mi-   самка,          г. Абакан      самок, всего                   
crotus rossiaemerid- adultus         (Красноярский  14 особей                      
ionalis Ognev, 1924                  край)                                         
Хромосомные расы     Самец,          Особи формы    6 самцов и 6  То же            
обыкновенная по-     самка,          «arvalis» из   самок формы                    
левки - Microtus ar- adultus         окр. д. Чаш-   «arvalis»,                     
valis Pallas, 1779:                  никово (Мос-   всего 12 осо-                  
M. arvalis arvalis                   ковская обл.). бей .                          
M. arvalis obscurus                  Особи формы    4 самца и 4                    
                                     «obscurus» из  самки формы                    
                                     окр. г. Ереван «obscurus»,                    
                                     (Армения)      всего 8 осо-                   
                                                    бей                            
Хомячок Кэмпбел-     Самец,          Лабораторная   35 самцов     Загривок, сред-  
ла - Phodopus        самка,          популяция от   и 20 самок,   небрюшная же-    
campbelli Thomas,    3 и 6 мес.,     особей-        всего 55 осо- леза             
1905                 весна, осень    основателей    бей                            
                                     из северо-                                    
                                     восточной                                     
                                     части Монго-                                  
                                     лии                                           

8

Введение

Окончание табл. 1

        Вид         Пол, возраст, Место добычи  Количество   Пробы кожи       
                        сезон                    изученных                    
                                                  особей                      
Джунгарский хомя-   Самец,        То же        15 самцов и   Загривок         
чок - Phodopus sun- самка, adul-               10 самок,                      
gorus Pallas, 1773  tus, весна,                всего 25 осо-                  
                    осень                      бей                            
Обыкновенный ёж -   Самец,        Московская   6 самцов      Загривок, веки,  
Erinaceus europaeus adultus,      область                    углы рта, аналь- 
Linnaeus, 1758      осень, весна                             ная область, ово                                                             лошенная часть   
                                                             подошв задних    
                                                             лап              

   Гистохимическими методами изучали сальные и потовые железы кожного покрова. Пробы кожи фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине на холоде в течение 24 ч. Толщина замороженных "плавающих" срезов составила 15 мкм. Гистохимические реакции проводили по методикам Гомо-ри (Берстон, 1965; Буданцев, 2008) в собственных модификациях к.б.н. Н.К. Джемухадзе специально для кожных желез: на кислую (КФ) и щелочную (ЩФ) фосфатазы и аденозинтрифосфатазу (АТФазу), при соблюдении условий контроля - идентичной параллельной обработки материала и контрольных реакций без субстрата. Специально для изучения кожного покрова отработана экспозиция инкубации (t = 37 °C) для каждой гистоэнзиматической реакции: на КФ с использованием ацетатного буфера (pH 5,0) - 2,0 ч; на ЩФ с использованием трисбуфера (pH 9,2) - 1,5 ч; на АТФазу с использованием трисбуфера (pH 7,2) - 2,0 ч. Для проверки морфологической идентичности структур препараты окрашивали гематоксилином по Карацци (Микроскопическая техника, 1996). Изучение препаратов проводили с помощью микроскопа марки "Carl Zeiss" (Германия, фирма-изготовитель "VEB Carl Zeiss Jena"). Результат фиксировали на основе просмотра каждого среза, последовательно смещая поле зрения микроскопа, изучая по 5-10 желез из одной пробы от каждой особи.
   Для адекватной оценки гистохимической активности ферментов следует учитывать критерии гисто- и цитохимических способов их выявления, базирующихся на объективных особенностях. Так, КФ выявляется в виде мелкой темной зернистости в клетках всех типов, при этом ее варьирующее коли

9

А.Б. Киладзе, Н.К. Джемухадзе. Квалиметрия в гистохимии ферментов

чество обнаруживается в зрелых секреторных клетках около протоков железы. Специфический продукт реакции на ЩФ представляет собой диффузно распределенную массу коричнево-серых оттенков, которая в высоких концентрациях содержится в малодифференцированных и созревающих клетках; фермент хорошо маркирует эндотелий кровеносных капилляров. Фермент АТФаза идентифицируется по красно-коричневому осадку разных оттенков, при этом он плотнее в малодифференцированных клетках, чем в зрелых. Подобная картина связана с собственно секреторным процессом, а внутриклеточное расположение осадков - с цитологической и цитохимической привязанностью изученных ферментов к внутриклеточным органеллам, при этом верификация постановки реакции обеспечивается следующими положениями:
   1)   КФ, ЩФ, АТФаза идентифицированы по своим свойствам с биохимическими показателями, описанными ранее в биосистемах;
   2)   при тщательном проведении гистоэнзиматических реакций классическими методами ложная локализация и артефакты исключаются;
   3)   изученные фосфатазы имеют свои четкие привязанности к внутриклеточным органеллам (лизосомам, митохондриям, клеточным мембранам), что обеспечивает истинность трактовки локализации преципитата.
   Сравнительно-гистохимический анализ результатов качественных гистоэнзиматических реакций основан на принципе гетерогенности содержания различных ферментов в кожных железах в зависимости от вида, пола, возраста животного, а также от сезона. Нас интересовало состояние зрелых клеток, которые, в конечном счете, и определяют характер выделяемого секрета.
   Для реализации квалиметрического метода необходимым условием является создание адекватной шкалы ферментной активности, поэтому мы провели ранжирование активности ферментов кожных желез с цифровым представлением результатов. Разработанная шкала, приведенная в табл. 3 (см. раздел 1.2.), была принята за основу в наших дальнейших исследованиях. Таким образом, активность ферментов приведена в двух форматах, а именно:
   1)   стандартное обозначение активности (СОА) в виде знаков;

10