Изучение биологических свойств штаммов возбудителей инфекционных болезней животных, выделенных на территории Российской Федерации, и сравнение их с находящимися в коллекциях возбудителями болезней, в том числе, общих для человека и животных, с целью оценки изменчивости их культуральных и морфологиче

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ 

ДЕПАРТАМЕНТ НАУЧНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ  

И ОБРАЗОВАНИЯ 

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  
УНИВЕРСИТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ 

 
 

 
 
 
 

 
 

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ  

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ, 
 ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ,  

И СРАВНЕНИЕ ИХ С НАХОДЯЩИМИСЯ В КОЛЛЕКЦИЯХ  

ВОЗБУДИТЕЛЯМИ БОЛЕЗНЕЙ, В ТОМ ЧИСЛЕ, ОБЩИХ  

ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ, С ЦЕЛЬЮ ОЦЕНКИ  

ИЗМЕНЧИВОСТИ ИХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ 

 СВОЙСТВ, ПАТОГЕННОСТИ, А ТАКЖЕ  ИЗУЧЕНИЯ  

ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К ФАКТОРАМ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ  

И ДЕЗИНФЕКЦИОННЫМ СРЕДСТВАМ.  

ИЗЫСКАНИЕ НОВЫХ ЭФФЕКТИВНЫХ СРЕДСТВ  

И МЕТОДОВ ДЕЗИНФЕКЦИИ 

 
 
 
 

Методические рекомендации 

 
 
 

 
 
 
 
 

Санкт-Петербург  

2021 

УДК: 619:616.98:579.648.61.648.63 
ББК: 48.4.48.2.48.1 
Джавадов Э.Д.,  Сухинин А.А., Макавчик С.А., Кузьмин В.А.,  

Фогель Л.С., Смирнова Л.И., Орехов Д.А. Изучение биологических свойств 
штаммов возбудителей инфекционных болезней животных, выделенных на территории 
Российской Федерации, и сравнение их с находящимися в коллекциях возбудителями 
болезней, в том числе, общих для человека и животных, с целью 
оценки изменчивости их культуральных и морфологических свойств, патогенности, 
а также  изучения их устойчивости к факторам внешней среды и дезинфекционным 
средствам. Изыскание новых эффективных средств и методов дезинфекции: 
методические рекомендации. – СПб, ФГБОУ ВО СПбГУВМ, 2021. – 35 с. 

 
В Методических рекомендациях на основании литературных данных и результа-

тов собственных исследований авторов представлены материалы по  комплексному  исследованию 
проблемы устойчивости возбудителей инфекционных болезней животных к 
антимикробным препаратам (АМП),   изменчивости их культуральных и морфологических 
свойств, патогенности. Необходимость комплексной оценки состояния чувствительности 
микроорганизмов к АМП обусловлена  решением различных задач: лечебных 
(выбор антибиотиков, антисептиков и бактериофагов); противоэпизоотических (выбор 
дезинфектантов, антисептиков, бактериофагов и антибиотиков); профилактических (выбор 
дезинфектантов и антисептиков). Описаны особенности лабораторной диагностики, 
в частности по сдерживанию и преодолению резистентности к АМП, управление этими 
процессами. Показана   роль дезинфекции и современных дезсредств в системе противоэпизоотических 
мероприятий. Представлены общие положения и схемы  применения испытанных 
и рекомендованных  для профилактической и вынужденной дезинфекций на  
объектах ветеринарного надзора  современных  импортозамещающих  дезинфектантов  
Аргенталин,  Фумийод, Кемицид, ЭХАР АКВАЭХА  с оценкой их эффективности.   

Методические 
рекомендации 
предназначены 
для 
студентов 
ветеринарных 

факультетов вузов, слушателей факультетов повышения квалификации, аспирантов, магистров,
сотрудников ветеринарных лабораторий,  практических ветеринарных врачей. 

 
Методические рекомендации составлены в соответствии с требованиями ФГОС 

ВПО по дисциплинам «Ветеринарная микробиология и микология» - ФВМ, «Микробиология» - 
ФВСЭ, ФБЭК, «Эпизоотология и инфекционные болезни» - ФВМ, «Основы эпизоотологии» - 
ФВБРиА, «Инфекционные болезни» - ФВСЭ.  

 
Методические рекомендации подготовлены в рамках реализации ГЗ МСХ России 

(2020) № 082-00041-20-00. - АААА-А20-120040790008-1 от 07.04.2020. 

Авторы/составители: Джавадов Э.Д.,  Сухинин А.А., Макавчик С.А., Кузьмин В.А., 

Фогель Л.С., Смирнова Л.И., Орехов Д.А. 

Рецензенты: Л.М. Белова – доктор биологических наук, зав. кафедрой паразитологии 

им. В.Л. Якимова ФГБОУ ВО СПбГУВМ; А.В. Забровская  – доктор  ветеринарных наук, 
старший научный сотрудник лаборатории кишечных инфекций  ФГБУН  ВО «Санкт-
Петербургский  научно-исследовательский Институт эпидемиологии и микробиологии  
им. Пастера» Федеральной службы  по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия 
человека (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера).  

Методические рекомендации одобрены и рекомендованы к изданию методическим советом 

ФГБОУ ВО СПбГУВМ (протокол №1 от 27.01.2021 г.). 

Методические рекомендации одобрены Координационным Советом по проблемам животно-

водства, ветеринарии и АПК Европейского Севера Северо-Западного центра междисциплинарных 
исследований проблем продовольственного обеспечения – обособленного структурного 
подразделения ФГБУН Санкт-Петербургский ФИЦ РАН (протокол № 1 от  12.01.2021 г.). 

© ФГБОУ ВО СПбГУВМ, 2021 

I. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ 
ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ, ВЫДЕ-

ЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ, И 

СРАВНЕНИЕ ИХ С НАХОДЯЩИМИСЯ В КОЛЛЕКЦИЯХ ВОЗБУ-

ДИТЕЛЯМИ БОЛЕЗНЕЙ, В ТОМ ЧИСЛЕ, ОБЩИХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА 
И ЖИВОТНЫХ, С ЦЕЛЬЮ ОЦЕНКИ ИЗМЕНЧИВОСТИ ИХ КУЛЬ-
ТУРАЛЬНЫХ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ, ПАТОГЕННОСТИ, 
А ТАКЖЕ  ИЗУЧЕНИЕ ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К ФАКТОРАМ 

ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ И ДЕЗИНФЕКЦИОННЫМ СРЕДСТВАМ. 

 

Введение 

Для современной инфекционной патологии животных характерно уве-

личение частоты появление новых возбудителей с измененными и ранее неизвестными 
свойствами гипервирулентных  Klebsiella  pneumoniaе  (hvKp –
hypervirulent K. pneumoniae), появление возбудителей, которые реже встречались 

раньше 
– 
Stenotrophomonas 
maltophilia, 
Histophilus 
somni, 

Actinobacillus ureae, Pantoea agglomerans, возбудителей атипичных пневмоний, 
маститов у животных (Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovis и др.). 
Связано с тем, что повышается чувствительность новых методов, с внедрением 
в лабораторную диагностику новых экспресс-методов, с разработкой и 
внедрением тест-систем и амплификационных тестов для диагностики.  

В настоящих рекомендациях систематизированы методические подхо-

ды к реализации эпизоотологического надзора за возбудителями инфекций, 
проводимого с использованием современных методов диагностики и изучения 
антимикробной активности в отношении патогенных и условно-
патогенных видов микроорганизмов. 

В настоящее время все более актуальным является внедрение совре-

менных достижений молекулярной биологии в систему эпизоотологического 
надзора за инфекционными болезнями животных. Развитие молекулярной 
эпизоотологии определяется нарастающим многообразием патогенных вариантов 
микроорганизмов, связанных  с определенными  процессами:  

1) возникновение новых эпизоотологических клонов;  
2) антибиотикорезистентность за счет хромосомных и внехромосом-

ных механизмов приобретения;  

3) антигенная дивергенция возбудителя с вакцинными штаммами и 

потеря актуальности вакцин;  

4) реверсия патогенности живых вакцин;  
5) маскировка патогенов вследствие межвидовой рекомбинации; 
6 появление новых онкогенных генотипов бактерий и вирусов и уси-

ление их циркуляции;  

7) возврат ликвидированных инфекций животных вследствие заноса 

возбудителей из эпизоотологически неблагополучных регионов мира. 

Молекулярно-генетический мониторинг позволяет выявить процессы, 

которые могут привести к - заносу (завозу) возбудителя в популяцию риска 

извне или направленную перестройку популяции возбудителя in situ (спонтанный 
генетический дрейф). 
 
1.1. Цель и задачи лабораторного мониторинга за возбудителями  
инфекций животных и птиц 

В настоящих методических рекомендациях под лабораторным мони-

торингом понимается слежение за популяционной структурой возбудителей 
инфекций животных с целью оценки, прогнозирования эпизоотической ситуации 
и обоснования своевременного вмешательства в ход эпизоотического 
процесса с применение инновационных методов (протеометрических и 
молекулярно-генетических). 

Задачи, выполняемые при осуществлении молекулярно-генетического 

мониторинга за возбудителями инфекций животных:  

1) внутривидовое типирование с целью определения генетической 

общности штаммов микроорганизмов, выделенных от заболевших животных, 
вероятного источника инфекции и факторов передачи при эпизоотических 
вспышках; 

 2) идентификация штаммов, заносимых (завозимых) в  животновод-

ческие и птицеводческие хозяйства;  

3) идентификация эпизоотических клонов;  
4) выявление штаммов с необычными биологическими свойствами, 

штаммов с высокой вирулентностью, резистентностью к АМП или вирулентностью 
в животноводческих и птицеводческих хозяйствах;  

5) динамическое слежение за эволюционными изменениями, происхо-

дящими в геномах и фенотипах возбудителей, с оценкой их эпизоотического 
значения;  

6) дифференциация истинных вспышек и псевдовспышек, возникших 

в результате неправильного отбора проб клинического материала для микробиологических 
исследований или внутрилабораторной контаминации в 
ветеринарных лабораториях. 
 
1.2. Общие принципы организации и проведения лабораторного  
мониторинга возбудителей инфекций животных 

Особое внимание необходимо уделять правильному отбору материала 

и его хранению до доставки в лабораторию. При отборе образцов необходимо 
соблюдать меры, предупреждающие обсеменение микроорганизмами 
объектов внешней среды. Осуществлять забор клинического материала 
только стерильными одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые 
флаконы, пробирки, контейнеры. Работать в одноразовых перчатках. 
Сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим 
материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности 
крышек, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями 
по данному вопросу. В направлении обязательно должна быть указана 
дата отбора, тип отобранного материала, условия его хранения, дата по-

следнего использования любого препарата и его название, например для лечения 
или вакцинации животных.  

Для доказательства существования связей между источником инфекции, 

факторами передачи и последующими случаями болезней используют методы 
внутривидового типирования микроорганизмов. При этом исходят из предположения, 
что штаммы возбудителя, выделенные от источника инфекции, с 
объектов внешней среды, являющихся факторами передачи, и от всех заболевших 
в очаге, связанных с источником инфекции, являются идентичными по 
своим биологическим свойствам (фенотипическим и генотипическим) в отличие 
от штаммов, не связанных с изучаемой эпизоотической цепочкой.  

Методы видовой идентификации и внутривидового типирования мик-

роорганизмов, проводимого с эпизоотологическими целями, подразделяют 
на фенотипические (также называемые традиционными или немолекулярными) 
и молекулярно-генетические (генотипические).  

К фенотипическим методам внутривидового типирования относят ме-

тоды, позволяющие устанавливать различия между штаммами микроорганизмов 
по способности утилизировать или использовать в качестве субстрата 
те или иные питательные вещества (биотипирование), особенности антигенной 
структуры (серотипирование, иммунный блоттинг), чувствительность 
к бактериофагам (фаготипирование), бактериоцинам (бактериоцино-
типирование) или АМП (антибиотикотипирование). 

 Фенотипические методы видовой идентификации и  типирования 

штаммов микроорганизмов не всегда обеспечивают получение достоверной 
информации вследствие следующих причин: 

 1. Невысокая информативная способность фенотипических методов 

типирования и идентификации микроорганизмов с измененными свойствами. 
Штаммы микроорганизмов, имеющие различное происхождение, могут 
иметь одинаковые фенотипические свойства в силу единообразия условий 
окружающей среды. Например, в разных отделениях одного животноводческого 
или птицеводческого комплекса, в которых используют одни и те же 
АМП, могут обнаруживаться штаммы возбудителей  с идентичным профилем 
устойчивости к АМП. Поэтому «антибиотикотипирование» не может 
быть использовано в качестве единственного метода при доказательстве 
эпизоотического распространения возбудителей из одного отделения животноводческих 
и птицеводческих хозяйств. 

2. Недостаточная воспроизводимость результатов фенотипических ме-

тодов типирования и идентификации микроорганизмов с измененными 
свойствами. В процессе культивирования на различных питательных средах 
могут происходить изменения биологических свойств, таких как мукоидный 
фенотип, способность к продукции пигмента, бактериоцинов и токсинов, 
чувствительность к АМП, включая бактериофаги и др. 

В целом, фенотипические методы типирования считают слишком ва-

риабельными, трудоемкими и медленными для успешного применения в 
эпизоотологическом мониторинге. 

Необходимо оптимизировать бактериологические методы исследова-

ний в ветеринарных лабораториях протеометрическими и молекулярно-
генетическими методами. 

Резистентность микроорганизмов  к дезинфицирующим  и антибакте-

риальным препаратам приводит к неэффективности применения дезинфек-
тантов и фармакотерапии. 

Важно изучать механизмы резистентности к дезинфектантам и анти-

микробным препаратам, проводить систему надзора и контроля за антимикробной 
резистентностью микроорганизмов и дезинфекцией объектов ветеринарного 
надзора.  
 
1.3. Показания к проведению идентификации возбудителей инфекций 
животных протеометрическим и молекулярно-генетическим методами  

Оптимизация бактериологических исследований позволяет обнаружи-

вать и идентифицировать возбудителей с измененными свойствами, редкими 
фенотипами микроорганизмов. Расширение возможностей видовой расшифровки 
возбудителей. 

Микробиологический мониторинг необходимо проводить с целью 

изучения биологических свойств штаммов возбудителей инфекционных болезней 
животных, выделенных на территории Российской Федерации - прогнозирование 
эпизоотологической и эпидемической ситуации: Возбудители 
способны покидать природные биотопы, преодолевать межвидовые барьеры, 
распространение антимикробной резистентности и т.д., что является 
биологической угрозой. (Указ Президента РФ от 11 марта 2019 г. № 97 «Об 
Основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения 
химической и биологической безопасности на период до 2025 года 
и дальнейшую перспективу»).  

Необходимо упростить методы работы с труднокультивируемыми мик-

роорганизмами (например, микоплазмами) и адаптировать их к современным 
условиям, чтобы сделать более доступным бактериологическое лабораторное 
исследование образцов от животных на наличие этих возбудителей. 

Микроорганизмы с мукоидным фенотипом, колонизирующие репро-

дуктивную, респираторную систему и молочную железу животных, объединяются 
в бактериальные сообщества, формируют общий защитный матрикс 
и становятся недоступными для антибактериальных препаратов  и факторов 
иммунной защиты  организма  хозяина. Благодаря этому феномену бактерии 
остаются жизнеспособными после антибиотикотерапии, которая приводит 
только к эрадикации планктонных форм.  

Видовую 
дифференциацию 
микроорганизмов 
с 
измененными 

биологическими 
свойствами 
(морфологическими 
и 
культурально-

биохимическими) сложнее провести с использованием стандартных 
микробиологических тестов. 

Применение методов молекулярно-генетического или протеометриче-

ского типирования позволяет сократить время, затрачиваемое на идентифи-

кацию эпизоотически значимых штаммов микроорганизмов, и своевременно 
проводить противоэпизоотические мероприятия. 

1.3.1. Протеометрический метод. Метод MALDI–TOF–MS анализа ре-

комендуется для применения в рутинной практике микробиологических лабораторий 
при видовой идентификации УПМ. Технологическое усовершенствование 
условий культивирования и методологических способов ведения масс-
спектрометрического исследования позволяют достоверно повысить качество 
видовой идентификации труднодиагностируемых микроорганизмов: нефер-
ментирующих бактерий, коринебактерий и дрожжевых грибов. 

Масс-спектрометрия (MALDI TOF) матричная время-пролетная 

мaсс-спектрометрия позволяет проводить точную идентификацию более 
4000 видов микроорганизмов, сокращая при этом сроки идентификации 
на 24–72 часа. Один из важных показателей – экономичность методики, 
которая почти не требует затрат на реактивы и расходные материалы. В 
клинической микробиологии позволяет с высокой точностью определить 
количественный и качественный состав вещества, его структуру, физико-
химические реакции. 

Масс-спектрометры используются для: 
- идентификации в биологических средах – мицелиальных грибов, 

дрожжей, грамположительных и грамотрицательных бактерий, бацилл, кло-
стридий. 

- видового типирования бактерий – выявления их родовой и видовой 

принадлежности, 

- определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. 
Современные масс-спектрометры состоят из нескольких устройств: 
- источника ионов – преобразует составляющие неорганического или 

органического вещества – нейтральные молекулы и атомы – в заряженные 
частицы – ионы, 

- микробиологического анализатора – разделяет заряженные ионы по 

времени пролета в масс-спектрометре определенного расстояния, 

- детектора – фиксирует сигнал ионов. 
MALDI (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) 

представляет собой «мягкий» способ ионизации. Вспомогательная матрица 
снижает разрушительные свойства лазерного излучения, что обеспечивает 
ионизацию крупных биомолекул без деградации. 

TOF (Time of Flight) – принцип работы анализатора масс-

спектрометра. Он фиксирует время пролета заряженными частицами конкретного 
расстояния и разделяет ионы по этому фактору. Время пролета при 
этом пропорционально отношению массы частицы к ее заряду. 

В процессе измерений выводится спектр константных рибосомальных 

белков неизвестных микроорганизмов, в дальнейшем сравниваемый с базой 
данных. 

Преимущества нового метода масс-спектрометрии: 
- Быстрота проведения исследования 

- Точность и достоверность результата 
- Подключение масс-спектрометра к автоматическим системам иден-

тификации микроорганизмов 

 - Экстракция белков может быть проведена непосредственно на 

слайде. 

- Уверенность: одноразовые слайды исключают риск контаминации и 

не требуют мытья. 

- Высокое разрешение: высокая воспроизводимость идентификации 

спектров белков микроорганизмов в диапазоне > 10 кДа. Возможность сканирования 
до 500 кДа. 

- База данных состоит из клинически значимых видов и более 25 000 

спектров. Надежная валидация с использованием Расширенного Классификатора  
Спектров для достоверной идентификации. Для каждого вида в базе 
данных получены спектры большого количества штаммов. 

Метод выявляет уникальный набор белков микроорганизмов своеоб-

разный «отпечаток пальца»- «протеомная дактилоскопия». Позволяет проводить 
и субтипирование микроорганизмов. 

1.3.2. Молекулярно-генетический метод. Проведение молекулярно-

генетического типирования обязательно при оценке идентичности изолятов 
микроорганизмов, выявленных из различных источников, и нерезультативном 
применении при этом комплекса традиционных (фенотипических) методов. 


Образование L-форм обусловлено влиянием неблагоприятных факто-

ров внешней среды (например, применением антибиоиков и дезинфектан-
тов, действующих на клеточную стенку). В условиях организма больного 
животного даже тогда, когда антибиотикотерапия не применяется, многие 
факторы самого организма (лейкоцитарные ферменты, низкий рН, лизоцим, 
система комплемент-антитело и др.) могут способствовать образованию измененных 
форм бактерий, близких L-вариантам, а также применение антисептиков 
в животноводческих и птицеводческих хозяйствах. У микоплазм, в 
отличие от других бактерий, состояние L-форм, т.е. отсутствие клеточной 
стенки, является их обычным состоянием.   

В последнее время для выявления бактерий в любой форме 

существования широко применяются молекулярно-генетические методы, и, 
в первую очередь, полимеразная цепная реакция (ПЦР). 

 Методический 
подход 
на 
основе 
ПЦР 
позволяет 
обойти 

основную трудность, связанную с тестированием бактерий, находящихся в 
некультивируемом состоянии (НС), так как дает возможность заменить размножение 
бактерий как таковых, амплификацией видоспецифичного для 
данной бактерии фрагмента ДНК. 

Использование молекулярно-генетических методов для видовой иден-

тификации культивируемых бактерий: 

- идентификация изолятов с нетипичными свойствами, дифференциа-

ция фенотипически неразличимых  видов; 

- идентификация некультивируемых и медленнорастущих бактерий; 
- идентификация бактерий без предварительного культивирования, 

непосредственно в клиническом материале; 

- идентификация новых видов бактерий  
Оптимизация бактериологических исследований позволяет обнаружи-

вать и идентифицировать возбудителей с измененными свойствами, редкими 
фенотипами, атипичных микроорганизмов. Расширение возможностей 
видовой расшифровки возбудителей. 

При необходимости проведения диагностики болезни методом ПЦР 

ветеринарный врач всегда должен помнить:  

1. Нельзя отбирать образцы материала от животного, если после вак-

цинации прошло менее 2-х недель (недавняя вакцинация может быть причиной 
ложноположительного результата на соответствующие болезни животных).  


2. Если уже осуществлялось лечение, результат может быть ложноот-

рицательным, так как некоторые лечебные препараты ингибируют реакцию.  

3. Перед отбором материала лучше проконсультироваться с сотрудни-

ками лаборатории, так как при использовании тест систем разных производителей, 
могут существовать определенные особенности.  

4. Весь материал для исследования методом ПЦР должен доставляться 

в лабораторию с хладореагентом, либо в термосе со льдом. 

 5. Особое значение в использовании метода ПЦР имеет отбор и хра-

нение материала.  

6. Для ПЦР-исследования пригоден любой потенциально инфициро-

ванный материал; окончательный выбор материала для анализа должен 
определяться наиболее вероятным местом локализации возбудителя инфекции 
в конкретной стадии болезни.  

 Для исследования методом ПЦР используют кровь, молоко, фека-

лии, сперму, материал от абортированных плодов (содержимое брюшной 
полости и желудка), плаценту, плодные оболочки и паренхиматозные органы 
от абортировавших животных, корма (продукты) животного происхождения. 


Для своевременной диагностики, эффективного лечения и профилак-

тики инфекций животных необходимо проводить комплексные лабораторные 
исследования, которые включают молекулярно-генетические, протео-
метрические и бактериологические методы, что позволяет наиболее достоверно 
идентифицировать возбудителей  и определить их чувствительность к 
препаратам антибактериального действия, а также осуществлять регулярный 
серологический и биохимический мониторинг основного стада для исключения 
нарушений обмена веществ и развитие иммуносупрессии, что 
может усугубить воспалительный процесс и затруднить его лечение. 

Cеквенирование. Метод секвенирования позволяет определять последо-

вательность нуклеотидов – аденина, тимина, гуанина, цитозина – в молекуле 
ДНК.  

Цели секвенирования: 

1) расшифровка генома – определение количества генов, их протяжѐнно-

сти, локализации, функций;  

2) идентификация неизвестных микроорганизмов путем сравнения нуклео-

тидной структуры некоторых их генов с соответствующими последовательностями 
известных видов; 

3) определение мутаций в генах для выявления резистентных микроорга-

низмов и изучения молекулярных механизмов устойчивости; 

4) эпизоотологическое исследования (определение генетических различий 

штаммов одного вида, выделяемых в разное время и из разных источников, что 
необходимо для определения связей между циркулирующими в различных регионах 
микроорганизмов). Важны для выявления источников и механизмов 
распространения микроорганизмов, а также механизмов развития эпизоотий; 

5) выявления направлений эволюции микроорганизмов. На основании  се-

квенированных последовательностей строят дендрограммы, позволяющие 
оценивать сходство микроорганизмов и их происхождение.  

Этапы секвенирования. 
1. 
Проведение ПЦР. Позволяет получить множественные копии 

небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000 нуклеотидов. 
Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при проведении их 
электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в один 
нуклеотид. 

2. 
Очистка амплифицированных фрагментов ДНК. Проводят очистку 

ампликонов 
от 
остатков 
ПЦР 
реакции 
(праймеров, 
несвязавшихся 

нуклеотидов). 

3. 
Секвенирование. Проводят ряд последовательных стадий :  

а) приготовление реакционной смеси, которая содержит:  

- изучаемую ДНК,  
- праймер, 
- ДНК-полимеразу и буфер для неѐ,  
- дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ),  
- меченые флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотиды, которые 

обрывают синтез цепочки ДНК, так как лишены 3'-OH группы, необходимой 
для образования мостика между двумя нуклеотидами;  

б) проведение реакции ПЦР-секвенирования;  
в) 
электрофорез 
в 
агаровом 
геле 
для 
разделения 
ампликонов, 

отличающихся размерами в один нуклеотид; 

г) получение линейного символьного описания атомной структуры 

молекулы ДНК. 

4. 
Биоанализ первичной структуры ДНК с помощью компьютерных 

программ для получения необходимой информации. 

Секвенирование 
16S 
РНК 
применяется 
как 
референс-метод 
для 

идентификации микроорганизмов.